[發明專利]一種L-草銨膦-N-羧酸酐及其制備和應用

有效

• 申請號: 201410797907.5
• 申請日: 2014-12-19
• 公開（公告）號: CN104558033A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 王宇光;朱冰春;吳冬梅
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C07F9/653
• 分類號: C07F9/653;C12P41/00;C12P17/14;C07F9/30;C12R1/06
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

1.一種如式(Ⅳ)所示的L-草銨膦-N-羧酸酐，

2.一種制備權利要求1所述的L-草銨膦-N-羧酸酐的方法，其特征在于所述的方法為：以嗜煙堿節桿菌(Arthrobacter?nicotinovorans)WYG001經發酵培養獲得的濕菌體或濕菌體經冷凍干燥后的干菌體為酶源，以DL-草銨膦-N-羧酸酐為底物，以pH?7.0、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液為反應介質，在20～50℃、200rpm條件下進行反應，反應完全后，將反應液分離純化，獲得式(Ⅳ)所示L-草銨膦-N-羧酸酐；所述嗜煙堿節桿菌WYG001，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC?NO:M?2014054，保藏日期2014年2月28日，地址為中國，武漢，武漢大學，郵編430072。

3.如權利要求2所述L-草銨膦-N-羧酸酐的制備方法，其特征在于所述濕菌體的用量以緩沖液體積計為3～150g/L。

4.如權利要求2所述L-草銨膦-N-羧酸酐的制備方法，其特征在于所述干菌體的用量以緩沖液體積計為1～50g/L。

5.如權利要求2所述L-草銨膦-N-羧酸酐的制備方法，其特征在于所述底物的初始濃度為1～50g/L緩沖液。

6.如權利要求2所述L-草銨膦-N-羧酸酐的制備方法，其特征在于所述的反應在20～50℃、200rpm條件下反應1～30h。

7.如權利要求2所述L-草銨膦-N-羧酸酐的制備方法，其特征在于所述酶源的制備方法為：

(1)斜面培養：將嗜煙堿節桿菌WYG001接種至斜面培養基，30℃培養24h，獲得菌體斜面；每升斜面培養基組成：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl?5g，瓊脂20g，pH?7.0-7.2，加水至1000mL；

(2)種子培養：從斜面菌體挑取一接種環菌體接種至種子培養基，在30℃、200r/min培養24h，獲得種子液；種子培養基組成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl?10g/L，溶劑為水，pH?7.0；

(3)發酵培養：在無菌條件下，以體積濃度6-8％的接種量將種子液接種于產酶培養基中，30℃、200r/min培養24h，獲得發酵液，培養結束后將發酵液12000rpm離心10min，棄上清液，得到嗜煙堿節桿菌WYG001濕菌體；產酶培養基組成為：乳糖8-12g/L，酵母膏12g/L，NaCl?10g/L，MgSO₄0.22g/L、KH₂PO₄0.136g/L，溶劑為水，pH?7.0；

(4)取步驟(3)濕菌體以1.2g/ml的量加入pH?7.0、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液中，攪拌均勻，-80℃條件下冷凍干燥，得到干菌體。

8.如權利要求2所述L-草銨膦-N-羧酸酐的制備方法，其特征在于所述反應液分離純化的方法為：反應結束后，將反應液過濾，濾液用碳酸氫鈉或0.5M的鹽酸調節pH到6.5-7.0后用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層用水洗滌后減壓蒸餾至干，獲得L-草銨膦-N-羧酸酐。

9.如權利要求7所述L-草銨膦-N-羧酸酐的制備方法，其特征在于步驟(3)中產酶培養基組成為：乳糖10g/L，酵母膏12g/L，NaCl?10g/L，MgSO₄0.22g/L、KH₂PO₄0.136g/L，溶劑為水，pH?7.0。

10.一種權利要求1所述的L-草銨膦-N-羧酸酐在制備L-草銨膦中的應用，其特征在于所述的應用為：將所述的L-草銨膦-N-羧酸酐與質量濃度36-38％濃鹽酸混合，加熱回流，蒸干溶劑，向濃縮物中加入體積濃度95％的乙醇水溶液a，加熱回流，在回流狀態下，再每次加入2mL體積濃度95％的乙醇水溶液b，直到固體物質完全溶解，將反應液用冰水混合物冷卻到30℃，加入環氧乙烷，5-10℃靜置12小時，待結晶完全后，過濾，濾餅室溫真空干燥，得L-草銨膦；所述L-草銨膦-N-羧酸酐與環氧乙烷投料物質的量之比為1:2-4，所述濃鹽酸體積用量以L-草銨膦-N-羧酸酐物質的量計為6L/mol，所述95％的乙醇水溶液a的體積用量以L-草銨膦-N-羧酸酐物質的量計為1-3mL/mmol。