[發明專利]蘋果V-ATPase亞基基因MdVHA-B1S396A及其抗逆應用

有效

• 申請號: 201410797205.7
• 申請日: 2014-12-19
• 公開（公告）號: CN104531718B
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 郝玉金;胡大剛;孫翠慧
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/00
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本發明涉及一種蘋果V?ATPase亞基基因MdVHA?B1S396A及其抗逆應用，從蘋果中分離到了MdVHA?B1基因，然后通過兩輪PCR搭橋的方法將396位置處的絲氨酸殘基突變為丙氨酸得到MdVHA?B1S396A基因；該基因在蘋果王林愈傷中過量表達能進一步提高轉基因蘋果愈傷的表達水平，同時進一步增強轉基因蘋果愈傷的抗鹽等逆境能力。

一、技術領域

本發明涉及一種蘋果V-ATPase亞基基因MdVHA-B1S396A及其抗逆應用，具體涉及一種蘋果V-ATPase亞基基因MdVHA-B1S396A的載體構建及其轉基因蘋果愈傷在抗鹽逆境方面的分析和應用，屬于分子生物學和生物技術領域。

二、背景技術

植物一生中經常遭受各種不良環境和病蟲害的侵襲，在長期的適應與進化過程中，植物形成了一系列防御反應機制，用來抵抗不良環境的傷害。其中，環境脅迫主要包括各種生物脅迫和非生物脅迫。生物脅迫主要來自昆蟲、食草動物、植物病菌等；非生物脅迫種類眾多，包括干旱、鹽漬、極端溫度、化學污染和氧損傷等脅迫。為了適應繁雜多變的環境，減少不利環境對機體的傷害，植物體內演化出了涉及多基因、多信號途徑、多基因產物的復雜過程。

蘋果是世界性果品，是溫帶地區的主要栽培樹種。其適應能力較強，果品營養價值較高，耐貯性好，供應周期長，世界上很多國家都將其列為主要消費果品而大力支持。但是在蘋果的生長發育過程中，許多非生物脅迫是影響蘋果地理分布和產量提高的主要限制因子，尤其是高鹽、干旱和低溫等，世界蘋果生產國都把選育抗鹽、抗旱、抗寒等優質蘋果新品種作為主要育種目標。由于蘋果是多年生木本植物，遺傳背景復雜、雜和度高、童期長、自交親和性差等諸多問題給遺傳育種帶來了很大障礙，常規育種進展緩慢。而蘋果愈傷組織是研究植物生長、分化、發育及抗性生理等良好的實驗體系，也是植物種質離體保存、細胞工程材料創建以及遺傳轉化體系建立等重要工作的基礎。并且近年來，隨著蘋果基因組的測序(Velasco等，2010)的完成、以及迅速發展的現代生物技術為解決這些問題開辟了新途徑，通過基因工程技術有目的提高果樹抗鹽、抗旱、抗寒能力，成為果樹遺傳改良的重要研究方向，大量植物抗逆功能基因的分離和鑒定則為基因工程遺傳改良提供了目的基因。

V-ATPase普遍存在于真核細胞中不同內酸性細胞器膜上。它是由兩個亞復合體組成的多亞基酶：外部的V1復合體主要負責ATP水解，膜內嵌的V0復合體主要負責質子轉運(Gaxiola等,2007)。V-ATPase活性主要取決于復合體的可逆組裝和V-ATPase亞基基因的動態表達(Kane,2012；Liberman等,2013)。編碼這些V-ATPase亞基的基因被確定與V-ATPase活性正相關，在植物(或細胞)生長發育及對非生物脅迫的響應中發揮至關重要的作用(Gaxiola等,2007；Silva和Gerós,2009；Hu等，2012)。在擬南芥和蘋果中，V1亞基VHA-B存在三種亞型(為VHA-B1，VHA-B2和VHA-B3所編碼)具有序列和功能上的差異(Gaxiola等,2007)。

目前對V-ATPase亞基基因的研究主要集中在擬南芥、水稻，小麥上等少數模式植物上，而在果樹方面研究較少。由于諸多方面的原因，可耕土地面積越來越少，再加上低溫、干旱、土壤鹽漬化和病、蟲害導致果樹的種植面積和范圍受到嚴重影響。因此挖掘蘋果V-ATPase亞基基因并進行功能研究，為果樹抗逆轉基因育種提供潛在的有效候選基因，不但具有重要的理論意義，而且具有廣泛的應用價值。蘋果轉基因育種多在蘋果砧木上進行，而蘋果砧木主要生活在地下，不開花坐果，減少了基因工程在果樹應用上的爭議。