[發明專利]一種用于檢測轉移性結直腸癌化療療效和/或預后的生物標志物組合及其應用

有效

• 申請號: 201410794712.5
• 申請日: 2014-12-18
• 公開（公告）號: CN104774916A
• 公開（公告）日: 2015-07-15
• 發明（設計）人: 張辰宇;巴一;曾科;李佳璐;陳熹
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種用于檢測轉移性結直腸癌化療療效和/或預后的生物標志物組合及其應用。

背景技術

結直腸癌是一種原發于大腸的惡性腫瘤，包括結腸癌和直腸癌。結直腸癌因其發部位不同而表現出不同的臨床癥狀及體征，主要有腹痛、便血、腹部包塊、腸梗阻等，伴或不伴貧血、發熱和消瘦等全身癥狀。在我國，結直腸癌作為第三大腫瘤，其發病率及死亡率近年來逐年上升。由于診斷技術的不斷提高，使新發結直腸癌病例中非轉移性疾病的比例大大增加，對于這部分患者，外科手術及輔助化療是主要治療手段。但是目前尚缺乏有效的預后判斷及化療療效評價指標。目前臨床上主要依據基于臨床病理指標(如腫瘤大小、淋巴結轉移數目、遠處轉移、組織分級等)的TNM分期作為疾病預后的判斷及指導臨床治療，但根據此分期判斷患者預后存在較大的異質性，亦不能預測腫瘤患者對化療的反應。

研究表明Ⅱ、Ⅲ期結直腸癌患者經過標準治療后仍有20％‐30％出現復發,其中40‐50％復發發生在原發灶切除后一年內，80％復發發生在原發灶切除三年內，復發后5年生存率低于1％。約有50％結直腸癌患者最終會進展為轉移性疾病而死亡。轉移性結直腸癌患者僅有極少數可以經手術及化療而得到治愈，全身化療是這類患者的主要治療方法，以氟尿嘧啶藥物為基礎聯合奧沙利鉑或者伊立替康方案已成為晚期結直腸癌的標準治療方案。此外，近年來抗血管生成藥物(貝伐珠單抗)或表皮生長因子單抗(西妥昔單抗或帕尼單抗)聯合標準化療使有效率進一步提高，但有相當一部分病人在治療時出現化療藥物耐藥甚至開始即出現不敏感最終因疾病進展而死亡。因此，篩選出對化療敏感的人群在臨床實踐中顯得尤為重要，可使化療無效人群避免不必要的毒副作用及承擔巨大的經濟負擔，但至今尚沒有有效的手段用于化療藥物敏感人群的選擇，尋求有效的標志物用于化療敏感性指標具有極大的應用前景。

微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一類長約19至23個核苷酸的非編碼單鏈小核糖核酸分子,其主要功能是參與基因轉錄后水平調控。miRNA通過與靶mRNA?3’端非翻譯序列完全或部分互補結合,導致靶mRNA降解或轉錄后翻譯抑制從而調控靶基因的表達。miRNA參與1/3人類蛋白編碼基因調控，它與多種生理活動有關，如生長發育、細胞增殖、細胞凋亡、細胞分化等；也與許多疾病的發生發展密切相關，如糖尿病、心血管疾病、腫瘤等。最近的研究顯示^[1-3]，miRNA在腫瘤發生、發展過程中發揮抑癌基因或癌基因樣作用。已證實，腫瘤組織和腫瘤細胞中的某些miRNA表達水平發生了變化，相對于正常組織，一些miRNA表達量顯著上升或下降。許多癌組織如肺癌、乳腺癌和食管癌等組織都有若干組織特異性miRNA的表達，提示miRNA有腫瘤組織特異性。另外，miRNA的表達也與腫瘤分化程度以及預后有關。最近，大量的研究結果揭示，miRNA在血清中能長期穩定存在，耐RNA酶的降解，一些腫瘤包括非小細胞肺癌、結直腸癌、前列腺癌、卵巢癌和胰腺癌患者血清中miRNA表達譜與正常人有顯著差異，均有各自特異的表達譜，同時這種變化還可見于早期癌中。這種穩定存在于血清中的循環miRNA因其用于腫瘤等疾病的早期診斷、預后及療效判斷從而指導個體化治療顯示出潛在的臨床應用前景。

目前尚沒有利用無創傷性、取材方便的血液標本檢測與轉移性結直腸癌化療療效及預后生物標志物相關的特異性miRNA組合及檢測試劑盒。

發明內容

本發明的目的就在于通過對患者接受化療前的血清樣本miRNA進行檢測和比對，分析miRNA表達水平與化療敏感性的關系，聯系患者的生存資料及治療效果，篩選一組與轉移性結直腸癌化療療效及預后相關的血清miRNA，并利用這些miRNA的TaqMan探針制備出適用于臨床診療用途的試劑盒，為預測轉移性結直腸癌患者化療敏感性提供特異性的以及迅速的無創傷性檢測手段。

以下是對本發明的進一步描述：

一種用于檢測轉移性結直腸癌化療療效和/或預后的miRNA組合，其包括下列miRNA：miR‐135b及miR‐208b。

上述miRNA組合的篩選方法包括以下步驟(見圖1)：

(1)分別收集12例對奧沙利鉑(FOLFOX)敏感和不敏感患者化療前混合血清樣本，提取總RNA；

(2)采用高靈敏度、高精確性和高重復性的低密度芯片技術(TaqMan?low?density?Array?technology)進行miRNAs檢測，篩選在化療敏感組(PR+SD)及不敏感組(PD)間穩定差異表達的一組miRNA；