[發明專利]抗大菱鲆血清免疫球蛋白M的單克隆抗體及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201410787121.5
• 申請日: 2014-12-18
• 公開（公告）號: CN104448000B
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發明（設計）人: 戰文斌;張偉;唐小千;邢婧;繩秀珍
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C07K16/42
• 分類號: C07K16/42;C12N5/20;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司37201
• 代理人: 王鐸

技術領域

本發明涉及一種單克隆抗體及其制備方法與應用，具體涉及一種抗大菱鲆(Scophthalmus maximus)血清免疫球蛋白M的單克隆抗體及其制備方法與應用，屬于魚類分子免疫學技術領域。

背景技術

免疫球蛋白是魚類體液特異性免疫應答中最主要的效應分子，免疫球蛋白M是魚類中最早被發現的免疫球蛋白，也是硬骨魚類血清中含量最高的免疫球蛋白，在執行體液免疫應答中發揮著最主要作用。經過抗原刺激后，魚體可迅速產生產特異性的免疫球蛋白M抗體，分泌于魚類血液和粘液等液體中，具有抗菌、抗病毒、中和毒素的免疫活性，也可以介導凝集作用和調理作用。另外膜結合型免疫球蛋白M分布于成熟B淋巴細胞表面，可以作為膜表面抗原受體，是B細胞識別識別抗原的重要物質基礎。單克隆抗體由于其特異性強、靈敏度高等優點，成為研究魚類免疫球蛋白的重要工具。因此，制備抗大菱鲆免疫球蛋白M的單克隆抗體，可用于大菱鲆血清中免疫球蛋白M水平及淋巴細胞的檢測，為大菱鲆免疫系統及免疫應答動態等研究提供有力工具。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種由雜交瘤細胞分泌的抗大菱鲆血清免疫球蛋白M的單克隆抗體。

本發明的另一個目的是提供上述抗大菱鲆血清免疫球蛋白M單克隆抗體的制備方法與應用。

本發明的目的是由以下技術方案實現的：一種抗大菱鲆血清免疫球蛋白M的單克隆抗體，所述的單克隆抗體是由名稱為：雜交瘤細胞株Sm-IgM，保藏單位為：中國典型培養物保藏中心，地址：湖北省武漢市武漢大學，保藏號為：CCTCC NO: C2014158，保藏日期為：2014年9月2日的雜交瘤細胞分泌的。

在倒置顯微鏡下觀察，生長狀態良好的該雜交瘤細胞分裂旺盛、外觀飽滿、渾圓、折光性強、細胞大小均一、貼壁良好；該雜交瘤細胞有無限分裂增生能力；長勢良好的該雜交瘤細胞常規培養2-3天，其培養基由桃紅色轉變為黃色，其中含有該雜交瘤細胞分泌的大量抗大菱鲆血清免疫球蛋白M的單克隆抗體。

一種所述抗大菱鲆血清免疫球蛋白M單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：將大菱鲆血清經鹽析結合柱層析法純化得到大菱鲆血清免疫球蛋白M；以純化的大菱鲆血清免疫球蛋白M為抗原免疫BALB/c小鼠；融合被免疫小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞；經免疫學檢測篩選方法，篩選出分泌抗大菱鲆血清免疫球蛋白M單克隆抗體的雜交瘤細胞Sm-IgM，其分泌的抗體即為抗大菱鲆血清免疫球蛋白M的單克隆抗體。

所述的鹽析結合柱層析法，是將大菱鲆血清經飽和硫酸銨分步鹽析后，經HiTrap? Protein A親和層析柱進一步純化得到大菱鲆血清免疫球蛋白M。

所述的免疫學檢測篩選方法是間接酶聯免疫法、間接免疫熒光法和轉印免疫印跡法；其中所述的間接酶聯免疫法是將細胞融合后所得的雜交瘤細胞培養上清液與純化的大菱鲆血清免疫球蛋白M于96孔酶標板中反應；繼而加入辣根過氧化物酶（AP）標記的羊抗鼠抗體；405 nm工作波長測定各孔光吸收值，篩選抗大菱鲆免疫球蛋白M的單克隆抗體。所述的免疫熒光法是雜交瘤細胞Sm-IgM分泌的單克隆抗體與大菱鲆外周血白細胞懸液于培養板孔中反應；繼而加入異硫氰熒光素（FITC）標記的羊抗鼠抗體；取部分細胞滴于載玻片上，用熒光顯微鏡觀察，確定該單抗可與淋巴細胞膜表面免疫球蛋白M發生特異性結合。所述的轉印免疫印跡法是將雜交瘤細胞Sm-IgM分泌的抗大菱鲆血清免疫球蛋白M的單克隆抗體與轉移至硝酸纖維素膜的大菱鲆血清免疫球蛋白M反應，確定該單抗的抗原決定簇位于分子量為78 kDa的大菱鲆免疫球蛋白M的重鏈上。

所述的雜交瘤細胞Sm-IgM分泌的單克隆抗體的應用為：利用ELISA方法檢測經滅活愛德華細菌免疫后大菱鲆外周血中特異性抗體水平的變化；利用流式細胞術檢測外周血白細胞中表面免疫球蛋白M陽性淋巴細胞比例。