[發(fā)明專利]南方根結(jié)線蟲MIF基因在降低線蟲對植株致病性中的應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201410781710.2
• 申請日: 2014-12-16
• 公開（公告）號: CN104651372A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 簡恒;趙建龍;李麗娟;劉倩;李爽
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/19
• 分類號: C12N15/19;C12N15/10;C12N15/11;C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.南方根結(jié)線蟲MIF基因在降低線蟲對植株致病性中的應(yīng)用，其特征在于，所述MIF基因?yàn)槿鏢EQ?ID?No.1所示的AMIF基因、如SEQ?ID?No.2所示的BMIF基因或如SEQ?ID?No.3所示的CMIF基因。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，通過抑制線蟲MIF基因的表達(dá)，降低線蟲對植物的為害。

3.南方根結(jié)線蟲MIF基因在培育抗南方根結(jié)線蟲轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用，其特征在于，所述MIF基因?yàn)槿鏢EQ?ID?No.1所示的AMIF基因、如SEQ?ID?No.2所示的BMIF基因或如SEQ?ID?No.3所示的CMIF基因。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，將BMIF基因編碼區(qū)的1-329bp作為RNAi干擾片段，構(gòu)建RNAi干擾載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得抗南方根結(jié)線蟲的轉(zhuǎn)基因植物。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，將BMIF基因編碼區(qū)的1-329bp作為RNAi干擾片段，按正反方向構(gòu)建于pSAT5干擾載體Intron兩側(cè)，再將含有BMIF正反向干擾片段和Intron區(qū)的大片段用XbaI/KpnI雙酶切從pSAT5載體上切下，連接于psuper植物表達(dá)載體，構(gòu)建psuper-BMIF-Ri植物轉(zhuǎn)基因RNAi干擾載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得抗南方根結(jié)線蟲的轉(zhuǎn)基因植物。

6.南方根結(jié)線蟲BMIF基因，其特征在于，所述BMIF基因的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

7.用于克隆權(quán)利要求6所述BMIF基因的引物，其特征在于，所述引物包括：

上游引物BMIF-superF：5’-ATGCCAATTTTACAAGTT-3’；

下游引物BMIF-superR：5’-TTATCCTTTTAATTTCCCATC-3’。

8.克隆權(quán)利要求6所述BMIF基因的方法，其特征在于，取接種南方根結(jié)線蟲45-60天的番茄根系，洗凈后挑取卵塊在無菌水中連續(xù)孵化3天，離心收集每天孵化的新鮮的二齡幼蟲；將洗凈的根經(jīng)過酶消解，分離、收集不同蟲態(tài)的線蟲；液氮冷凍，組織研磨器破碎樣品，用磁珠法提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄得到南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲cDNA，以該cDNA為模板，利用權(quán)利要求7所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增體系為：ddH₂O?28μL，5×Phusion?HF?buffer?10μL，2.5mM?dNTPs?4μL，BMIF-superF?2.5μL，BMIF-superR?2.5μL，cDNA?1.0μL，Phusion?DNA?polymerase(NEB)0.5μL，DMSO?1.5μL,總體系50μL。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增條件為：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，58℃退火30s，72.0℃延伸1min，共30個循環(huán)；72.0℃保溫10min后終止反應(yīng)。