[發明專利]一株高凝聚性戊糖片球菌及其在凈化水體中副溶血性弧菌中的應用

在審

• 申請號: 201410780421.0
• 申請日: 2014-12-17
• 公開（公告）號: CN104611255A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發明（設計）人: 楊振泉;高璐;饒勝其;靳彩娟
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/00;A01P1/00;C12R1/01
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 戴朝榮

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一株從發酵豆制品中篩選出的具有高凝聚活性的戊糖片球菌及其在凈化水體中的副溶血性弧菌中的應用。

背景技術

副溶血性弧菌（Vibrio?parahaemolyticus），廣泛分布于近岸海洋及江河入海口，是海產品引發食物中毒的重要病原菌，也是水產動物細菌性疾病的重要致病因子。目前，防治水生動物弧菌病、降低水體中副溶血性弧菌載量的重要手段是使用抗生素及化學制劑，但隨之導致耐藥性細菌產生及抗生素殘留等問題，對食品安全造成重大影響，因此亟需開發新的手段來進行水體減菌和凈化處理。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一株具有高凝聚活性的戊糖片球菌，可用于水體中的副溶血性弧菌的減菌和凈化處理，而避免使用化學抑菌劑和抗生素來進行水體減菌和凈化處理，為養殖和暫養水體中的副溶血性弧菌的生物控制提供新的手段，同時有利于預防副溶血性弧菌引起的水生動物疾病和食源性疾病的傳播。

本發明從發酵豆制品鹵水中分離出一株戊糖片球菌F28-8（Pediococcus?pentosaceus），保藏在中國微生物菌種保藏管理委員普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝陽區北辰西路1?號院3號中國科學院微生物研究所，其菌種保藏編號為：CGMCC?No.9956，保藏日期為2014年11月13日，菌種的分類命名為戊糖片球菌，Pediococcus?pentosaceus。

本發明中的戊糖片球菌F28-8具有以下生物學特性：

（1）?形態特征：戊糖片球菌F28-8革蘭氏染色結果為陽性，細胞呈圓球形，成對或四聯排列，無芽胞，無莢膜，無鞭毛。

（2）菌落特征：戊糖片球菌F28-8在MRS?固體培養基上生長良好，菌落形態為圓形、乳白色、光滑、凸起，邊緣整齊，不透明。

（3）生理生化特征：過氧化氫酶陰性，不產生吲哚、硫化氫和氨，不還原硝酸鹽，不水解精氨酸，可發酵葡萄糖，不發酵山梨糖、蜜二糖、木糖醇、蔗糖、乳糖、松三糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、甘露醇；可從纖維二糖、七葉苷、藫糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖發酵產酸。

（4）對副溶血性弧菌具有強烈的凝聚性和抑菌性。

本發明從發酵豆制品中的戊糖片球菌中分離出戊糖片球菌分離株，通過測定其對副溶血性弧菌的抑菌特性和共凝聚能力，篩選出具有高凝聚力的戊糖片球菌，并通過電鏡來觀察不同凝聚力的戊糖片球菌菌株的表面微觀結構，測定其對水體中致病性副溶血性弧菌存活率的影響來考察其對水體中副溶血性弧菌凈化效應，具體包括以下步驟：

（1）菌株復蘇培養??戊糖片球菌F28-8接種5?mL?MRS液體培養基，tdh基因陽性的致病性副溶血性弧菌ATCC33847接種?LBS液體培養基，備用。

（2）抑菌能力測定??用瓊脂孔擴散法，通過測定戊糖片球菌菌株無細胞提取液對副溶血性弧菌在LBS固體平板上的抑菌圈的大小來檢測其抑菌能力。

（3）共凝聚能力測定??調節戊糖片球菌的菌懸液的濃度，將調好濃度的戊糖片球菌懸液與相應的副溶血性弧菌菌懸液各取混合，測定吸光值，記作Amix，以未混合戊糖片球菌的副溶血性弧菌菌懸液作為對照，按照以下公式：{[(Ap+Av)/2]-Amix}/(Ap+Av)/2*100來計算細菌共凝聚率，其中Ap和Av分別為戊糖片球菌和副溶血性弧菌菌懸液在600?nm處測所測的A值。

（4）凝聚細胞的電鏡觀察??吸取自凝聚2?h的未混合戊糖片球菌的菌懸液樣品進行掃描電鏡，吸取共凝聚2?h的戊糖片球菌和副溶血性弧菌的混合菌懸液樣品進行掃描電鏡，分別觀察細胞的結構和凝聚特征。

（5）凝聚過程中副溶血性弧菌存活細胞測定?將戊糖片球菌和副溶血性弧菌混合菌懸液在37℃混合靜置培養2?h、12h、24h、60h、96h后，分別吸取樣品中上層和下層溶液通過選擇性TCBS瓊脂平板測定體系中的細菌濃度。

本發明的有益效果是：

戊糖片球菌（Pediococcus?pentosaceus），是乳酸菌中的一個種，廣泛分布于蔬菜、干酪、香腸等傳統發酵食品中，是公認的具有安全性的微生物。該菌代謝糖類產生乳酸，并產生IIa類片球菌素，對病原菌及腐敗微生物產生強烈的抑制效應，其中一些菌株具有提高動物天然免疫能力、促進健康以及抵抗病原菌的侵襲等益生特性，以戊糖片球菌及其代謝產物研發新型抑菌劑和微生態制劑對食品和環境中弧菌凈化控制以及弧菌病的生物防治具有潛在價值和廣闊前景。