[發(fā)明專利]一種鴨甲肝病毒VP1蛋白基因及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410775871.0
• 申請(qǐng)日: 2014-12-13
• 公開（公告）號(hào): CN104530230B
• 公開（公告）日: 2018-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 莊鴻章
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 惠安易成機(jī)電設(shè)備工程有限公司
• 主分類號(hào): C07K16/10
• 分類號(hào): C07K16/10;C12N15/51;C12N15/70;A61K39/29;A61P31/14
• 代理公司: 北京高航知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11530
• 代理人: 趙永強(qiáng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于功能基因改造技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鴨甲肝病毒VP1蛋白基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

鴨甲肝病毒(Duck hepatitis A viral，DHAV)主要感染1-3周齡雛鴨，是引起高度致病、傳播迅速的鴨病毒性疾病，死亡率高達(dá)90％以上。其呈世界范圍分布，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來極大的損失。鴨甲肝病毒主要分為3個(gè)基因型：A、B和C，對(duì)應(yīng)于三個(gè)血清型DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。DHAV-1最早是在1950年從美國分離得到，是經(jīng)典毒株，目前分布于世界各地，是中國目前流行的主要毒株。DHAV-3為最早分離自韓國的新型毒株。這三種血清型的相互無交叉保護(hù)或者僅有有限的交叉保護(hù)。

近年來流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國DHAV-3的持續(xù)出現(xiàn)，并經(jīng)常與DHAV-1的共感染，而國內(nèi)已經(jīng)批準(zhǔn)上市的鴨病毒性肝炎疫苗(鴨病毒性肝炎弱毒株A66株、CH60株)均為DHAV-1株，已不能對(duì)目前國內(nèi)復(fù)雜的鴨病毒性肝炎疾病提供有效保護(hù)。因此開發(fā)一種新型復(fù)合疫苗株，既可對(duì)DHAV-1又可對(duì)DHAV-3提供保護(hù)無疑對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

DHAV的VP1基因由714個(gè)堿基組成，編碼VP1蛋白大小為26.4kD，含有多個(gè)DHAV抗原表位，是鴨肝炎病毒主要的保護(hù)性抗原，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的抗體反應(yīng)并獲得免疫保護(hù)，是設(shè)計(jì)DHAV新型疫苗的首選目標(biāo)基因。本發(fā)明通過將DHAV-1和DHAV-3 VP1基因的優(yōu)勢(shì)抗原表位進(jìn)行重組、連接，成功獲得一段新型復(fù)合鴨甲肝病毒VP1蛋白基因，可用于新型鴨甲肝疫苗的開發(fā)和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種新型復(fù)合鴨甲肝病毒基因工程亞單位疫苗，即獲得一種新型復(fù)合的鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1，并以該結(jié)構(gòu)蛋白VP1作為抗原來制備復(fù)合鴨甲肝病毒基因工程亞單位疫苗。

本發(fā)明首先提供一種新型復(fù)合鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1，其編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:1；

上述蛋白的一種核苷酸序列為SEQ ID NO:2；

本發(fā)明還提供一種復(fù)合鴨甲肝病毒基因工程重組亞單位疫苗，其中的抗原為上述的復(fù)合鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1，其濃度為0.1-1mg/ml之間；

本發(fā)明的復(fù)合鴨甲肝病毒基因工程亞單位疫苗，其制備步驟如下：

1)將復(fù)合VP1基因連入表達(dá)載體中，構(gòu)建成表達(dá)重組質(zhì)粒；

2)將構(gòu)建的表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌,構(gòu)建了能表達(dá)復(fù)合鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的重組基因工程菌；用該重組基因工程菌表達(dá)出復(fù)合鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1；

3)對(duì)重組表達(dá)的VP1蛋白進(jìn)行純化后，加入白油佐劑制成疫苗。

本發(fā)明利用pET28a(+)表達(dá)性載體構(gòu)建了能表達(dá)復(fù)合鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌。經(jīng)SDS-PAGE分析，表達(dá)出了20kD重組目的蛋白。將重組蛋白純化后制備成基因工程亞單位疫苗，免疫4月齡麻鴨(產(chǎn)蛋種)，兩次免疫后可以使孵化的雛鴨獲得對(duì)DHAV-1和DHAV-3毒株的免疫保護(hù)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式來進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的技術(shù)方案的情況下可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，這些修改和替換均落入本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例1 新型復(fù)合鴨甲肝病毒VP1蛋白及其基因的獲得

1、對(duì)DHAV-1代表毒株(GenBank登錄號(hào)：GU363950.1)的VP1蛋白序列和DHAV-3代表毒株(GenBank登錄號(hào)：EU289393.1)的VP1蛋白序列進(jìn)行抗原性分析，分別選取DHAV-1的VP1蛋白優(yōu)勢(shì)抗原表位(94-146)與DHAV-3的VP1蛋白優(yōu)勢(shì)抗原表位(115-223)進(jìn)行拼接，中間加入蛋白lingker(GGGSGGGS)以促進(jìn)兩段序列的正確折疊，最終獲得的新型復(fù)合鴨甲肝病毒VP1蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。

2、根據(jù)獲得的新型復(fù)合鴨甲肝病毒VP1蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:1，根據(jù)大腸桿菌基因密碼子偏好性進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，獲得編碼復(fù)合鴨甲肝病毒VP1的核苷酸序列SEQ ID NO:2。將基因序列兩端加上BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)并送上海捷瑞生物工程有限公司全基因合成。

實(shí)施例2 基因工程蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建與工程菌的獲得