[發明專利]牛樟芝Biotin蛋白基因及其克隆和測序方法

在審

• 申請號: 201410769285.5
• 申請日: 2014-12-14
• 公開（公告）號: CN104726466A
• 公開（公告）日: 2015-06-24
• 發明（設計）人: 管榮良;陳國義;裘東輝;周龍;陳宇;王偉萍;王芳;王靜
• 申請（專利權）人: 上海勤生緣生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/10;C12Q1/68;C07K14/375
• 代理公司: 上海晨皓知識產權代理事務所(普通合伙) 31260
• 代理人: 成麗杰

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，特別涉及一種牛樟芝Biotin蛋白基因及其克隆和測序方法。

背景技術

生物素(Biotin)，又名維生素H，其分子式為C₁₀H₁₆N₂O₃S，分子量244.31，由一個咪唑環、一個四氫噻吩環和一個正戊酸側鏈組成。從生物素的化學結構看，其分子具有三個手性中心，應有8個不同的立體異構體。

天然狀態的生物素，從水中結晶出來為無色的細長針狀晶體，熔點232～233℃，它是一元弱酸，在熱水或弱堿中溶解，難溶于冷水，幾乎不溶于有機溶劑，其鈉鹽極易溶于水。其補充物為右旋生物素制劑，是一種近白色結晶性粉末，在冷水中溶解度低，隨水溫升高其溶解度增加，但高溫時穩定性受到影響，配制生物素溶液時，最適溫度為50℃左右。生物素是穩定性較好的一種維生素，對氧化、還原、微量元素都很穩定，強酸、強堿、紫外線對生物素稍有影響，生物素對熱敏感。

生物素在自然界普遍存在于動植物體內，尤其是動物的肝、腎、脾、酵母及蛋黃中比較豐富。生物素是羧化酶的輔酶，也是糖、蛋白質和脂肪中間代謝的重要輔酶。這些依賴生物素參與的羧化酶對催化葡萄糖、氨基酸和脂肪酸的代謝有至關重要的作用。生物素還作為輔酶成分參與其它營養物質如甲基轉移反應和糖代謝等代謝過程；與溶菌酶活化和皮脂腺的功能有關；還與微生物B₆、B₁₂、葉酸、泛酸的代謝密切相關。最近研究發現，生物素可能會影響基因表達。人體若缺乏生物素則會引起皮炎、食欲不振、惡心、嘔吐、脫發、體重降低、貧血、血中膽固醇升高和精神抑郁等病癥。若動物缺乏，將會導致生長遲緩和發育不良、皮炎、脫毛、神經過敏等癥狀。

生物素廣泛應用于飼料添加劑、醫藥、生物技術、食品和化妝品等方面。在醫藥方面，可用于治療各種生物素缺乏癥。近年來的研究發現，即使體內的生物素正常，給予一定的生物素也能治療多種疾病，特別是皮膚病，生物素也用于輔助治療糖尿病。除此之外，人體需要補充生物素還有多方面的原因。首先，生物素和葉酸、VB₁₂、VC、VB₁含量的變化。其次，卵蛋白和脂肪的攝入量越多，生物素的需求量越大。再次，人血液中生物素的含量隨年齡增長而降低，高血壓和動脈硬化的老年患者血液中生物素的含量比健康年輕人要低的多。所以，在多維制劑中一般需要加入生物素組分。生物素是維持動物正常生長、發育、繁殖及保持皮膚、羽毛和骨骼健康所必須的微生素，對幼齡動物尤其重要。另外，生物素還可用做食品營養強化劑，例如在運動員的飲料中加入生物素。

生物素(Biotin)是脂肪和蛋白質正常代謝不可或缺的物質，是一種維持人體自然生長和正常人體機能所必須的水溶性維生素，是代謝脂肪及蛋白質不可或缺的物質。牛樟芝是珍貴的藥用真菌，有祛風行氣、活血化瘀、溫中消結、解毒消腫、鎮靜止痛、抗菌、抗病毒及提高免疫力之效。牛樟芝是有許多的生理活性成分，其中就包含維生素、微量元素等，所以，研究牛樟芝的漆酶具有重要意義。本發明參考其它物種Biotin基因序列，克隆測序獲得牛樟芝Biotin基因的cDNA序列，并對不同物種Biotin基因的CDS序列進行同源性比較，旨在了解和驗證Biotin基因的結構特點，為今后研究Biotin基因與菌類漆酶提供基礎資料。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種牛樟芝Biotin蛋白基因。

本發明的另一個目的在于提供上述牛樟芝Biotin蛋白基因的克隆和測序方法。

為解決上述技術問題，本發明的實施方式提供了一種牛樟芝Biotin蛋白基因，該基因為一種生物素蛋白基因，具體來說，本發明的實施方式所提供的牛樟芝Biotin蛋白基因，該基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

同時，本發明的實施方式所提供的牛樟芝Biotin蛋白基因，其核苷酸序列編碼具有SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列的多肽。

本發明的實施方式還提供上述牛樟芝Biotin蛋白基因的克隆和測序方法，該方法包含以下步驟：

(1)組織分離：取牛樟芝菌絲，以重蒸水沖洗去除培養基及雜質，然后將組織樣迅速放入液氮中冷凍后于-70℃保存；

(2)總RNA的分離：從上述步驟(1)中凍存的組織樣中提取總RNA，通過分光光度計測定RNA含量，并采用瓊脂糖電泳分析進行總RNA的鑒定；