[發明專利]乳酸乳球菌在治療腸道腫瘤中的一種應用方法

在審

• 申請號: 201410767495.0
• 申請日: 2014-12-12
• 公開（公告）號: CN104523761A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 龐慶豐;范紅斌;杜斌;陳俊良
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: A61K35/744
• 分類號: A61K35/744;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明公開了乳酸乳球菌在治療腸道腫瘤中的一種應用方法，屬于生物醫藥領域。

背景技術

乳酸乳球菌(Lactococcus?lactis)是一類長期應用于食品發酵業的有益微生物，這種食品級微生物能經受胃腸液考驗并在人體內存活2～3天，其本身不攻擊腸黏膜并且不引起強的免疫反應，其中最有前景的應用即是乳酸乳球菌作為活載體將治療性蛋白或抗原傳遞至黏膜表面，繼而同時誘導黏膜免疫和系統免疫。乳酸乳球菌以其生長迅速、易于操作等優點成為表達外源蛋白、作為活載體疫苗傳遞抗原的理想選擇。乳酸乳球菌不屬于人和動物的正常微生物群，不會定植于口腔或胃腸道，在一定程度上避免了因為長期刺激形成的免疫耐受。

腸道作為一個免疫器官，起著阻隔細菌和內毒素的屏障作用。正常情況下，胃腸道中絕大多數細菌是對人體有益的，我們稱之為“益生菌”，可幫我們消化乳糖、降解并排泄多余膽固醇；為我們的機體提供多種維生素；刺激我們的免疫器官發育，并促使其功能不斷地演進、完善，有益人體健康。益生菌與我們的胃腸道粘膜共同筑成了一道生態屏障，抵御和抗擊各種外來的病原微生物，但在某些特定的情況下，如嚴重疾病、營養不良、過度疲勞或外來刺激時，機體的抵抗力會下降，一些原本無害的細菌可能會乘虛而入，對機體造成傷害，引起腸粘膜屏障功能下降。乳酸乳球菌是位于胃腸道中的益生菌，因此非常適合治療腸道疾病如腸道腫瘤等疾病。乳酸乳球菌能夠誘導表達白細胞介素-12(interleukin?12,IL-12)，IL-12主要由B細胞、T細胞、單核巨噬細胞產生的一種具有多種功能的細胞因子。它能夠促進NK細胞、T細胞的增殖和殺傷活性，誘導γ-干擾素等細胞因子的產生，調節TH1細胞的發育，具有良好的臨床應用前景。目前已經進入抗腫瘤、抗病毒性疾病和治療哮喘的Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗階段。人重組IL-12的臨床試驗提示人重組IL-12在治療腫瘤中具有肯定的效果。

發明內容：

本發明公開了乳酸乳球菌在治療腸道腫瘤中的一種應用方法，屬于生物醫藥領域。用于治療腸道腫瘤等疾病。

本發明通過以下實驗證明乳酸乳球菌在治療腸道腫瘤中的一種應用方法：用Nsi?I和EcoR?I雙酶切pGEM-IL-12質粒后，與經同樣酶切的含有乳鏈桿菌肽A(nisA)啟動子的pSEC-E7質粒連接，從而構建成pSEC-IL-12質粒；經電擊轉化，將重組質粒轉入乳酸乳球菌NZ9000中，轉化子在含有氯霉素的腦心浸液培養基上培養。用乳鏈桿菌肽(nisin)誘導IL-12表達，SDS-PACE、Western?blot鑒定表達產物；用酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測IL-12的量。可建立IL-12乳酸菌基因表達系統。在nisin的誘導下，NZ9000能夠產生并分泌IL-12約80ng/L。實驗結果證明乳酸乳球菌能夠表達一定數量的IL-12，對腸道腫瘤具有一定的治療作用。

具體實施方式

下面的實例將具體說明本發明的操作方法，但不能作為對本發明的限定。

1質粒、菌株及培養條件：乳酸乳球菌(Lactococcus?lactis)NZ9000和pSEC-E7質粒為法國農業科學院Luis教授贈送，大腸桿菌DH5α、pGEM-IL-12載體為本實驗室保存；其中大腸桿菌DH5α用于質粒pSEC-E及其衍生質粒保存或擴增的標準菌株，乳酸乳球菌NZ9000用作IL-12基因重組表達質粒pGEC-IL-12的表達菌株。大腸桿菌用LB培養基、乳酸乳球菌及其電穿孔轉化子用腦心浸液培養基培養。氨芐青霉素使用濃度為100mg/L，氯霉素使用濃度大腸桿菌為10mg/L、乳酸乳球菌為5mg/L。

2重組質粒的構建及轉化：用NSI?I和EcoR?I雙酶切pGEM-IL-12質粒后，與經同樣酶切的含有nisA啟動子的pSEC-E7質粒連接，從而構建成pSEC-IL-12質粒，pSEC-IL-12質粒含有Usp45信號肽。乳酸乳球菌轉化采用電穿孔轉化法(脈沖參數為1.25kV/mm,25μF和200歐姆)。重組質粒經電擊轉化乳酸乳球菌NZ9000，轉化子在含有氯霉素的腦心浸液瓊脂糖平板上生長。再從重組乳酸乳球菌中提取質粒pSEC-IL-12，進行電泳鑒定。在DH5α和NZ9000中提抽到的質粒DNA分子(條帶1和2)與轉化前的pSEC-IL-12(條帶1)在Marker的對照下，條帶處于同一位置高度，說明轉化是成功的。本實驗成功重組了能夠表達具有生物活性IL-12乳酸乳球菌，鑒于乳酸乳球菌為存在于胃腸道中的益生菌，因此非常適合于治療腸道疾病如腸炎、腸道腫瘤等疾病。