[發明專利]大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體的序列及用途

有效

• 申請號: 201410767405.8
• 申請日: 2013-02-28
• 公開（公告）號: CN104450722B
• 公開（公告）日: 2017-03-22
• 發明（設計）人: 陳伶利;葛金文;李杰
• 申請（專利權）人: 湖南中醫藥大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;A61K31/7088;A61P31/04;G01N33/68
• 代理公司: 北京弘權知識產權代理事務所(普通合伙)11363
• 代理人: 逯長明,許偉群

本發明是于2013年2月28日申請的申請號為201310062950.2、發明名稱為“大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體的序列及用途”的分案申請。

技術領域

本發明屬于分子生物學和醫學微生物技術領域，涉及大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體的序列及用途。

背景技術

大腸桿菌(Escherichia?coli)是埃希氏菌屬的代表菌，是構成人類腸道中的正常菌群之一，又是重要的條件致病菌，極易通過多種形式和途徑侵入腸道外的組織和器官，造成各種嚴重感染。隨著抗菌藥物的臨床廣泛應用，誘導了大量該菌屬耐藥菌株的產生，并形成了該菌對單一抗菌藥物耐藥到對多種抗菌藥物同時耐藥，由低耐藥率到高耐藥率的發展，給臨床治療帶來了極大的困難，導致較高的病死率。目前國內外對大腸桿菌的耐藥性機理展開了深入的研究。研究表明，主動外排泵為大腸桿菌多重耐藥的重要機制。大腸桿菌外排泵包括：RND、MFS、ABC、SMR、MATE五類，其中前三者必須與外膜蛋白(OMP)TolC構成轉運共同體，才能完成對多種藥物的外排，由此可見TolC是構成大腸桿菌外排泵的重要組成成分。TolC是位于外膜上的孔道蛋白，上端為開放結構，以便給外排底物提供泵出的寬闊通道；下端為封閉結構。外排泵三聯復合物構象的改變，可使孔道定期開放或閉合。TolC結構的改變會引起它們三者相互作用的減弱甚至三聯復合物的解體。在關于大腸桿菌外膜蛋白的研究報導中，很多結果提示了TolC蛋白在大腸桿菌的多重耐藥機制中起到至關重要的作用。但目前沒有報道通過改變該蛋白結構來抑制耐藥性。

適配體(Aptamers)的研究是一個新的熱點領域，它是能夠與許多目標分子(蛋白，藥物，無機或有機分子)發生高親合性和特異性結合的一類單鏈核酸(DNA?or?RNA)。至今發現高親和特異性適配體的方法是配體指數富集系統展開(systematic?evolution?of?ligands?by?exponential?enrichment，SELEX)。由于適配體與配體分子結合的高特異性以及高親和性，在醫學研究中被廣泛應用于檢測和藥物研究等方面。Yuan等(Yuan?L，et?al，Anal?Chem，2007，79(3)：1082)利用等離子體表面共振成像與適配子技術建立蛋白質芯片，檢測該蛋白質芯片上吸附的蛋白抗體凝血酶、血管內皮生長因子(VEGF)復合物。Cao等(Cao?X，et?al，Nucleic?Acids?Res，2009，37(14)：4621-8)利用篩選出的針對金黃色葡萄球菌的適配子來檢測金黃色葡萄球菌。

目前國內外大部分從事核酸適配體研究的科學家和生物技術公司主要將適配體運用于病毒感染、癌癥、自身免疫病、血管性疾病的臨床治療，并成為較為理想的臨床治療的新手段。其治療機制主要是通過折疊成一定的三維結構直接與病理學相關蛋白質特異性結合，抑制這些蛋白質的活性，以達到治療目的。Feng?H等(Feng?H，et?al，PLoS?One，2011，6(11)：e27862)篩選出了能與乙型肝炎病毒高親和力結合，干擾病毒P-ε復合物形成的適配體。但迄今尚無針對細菌外膜蛋白的適配體報道或公開，因此實有必要開發一種可特異性結合大腸桿菌外膜蛋白TolC的核酸適配體。

發明內容

本發明擬考慮將核酸適配體應用于改變TolC蛋白結構來有效阻塞大腸桿菌外排泵外排活性。開發可特異性結合大腸桿菌外膜蛋白TolC的核酸適配體，為抑制大腸桿菌多重耐藥提供有力支持，具有重要的臨床價值。

本發明的目的是提供一種可特異結合大腸桿菌外膜蛋白TolC的核酸適配體。該適配體具有如下序列：SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4、SEQ?ID?NO：5、SEQ?ID?NO：6、SEQ?ID?NO：7、SEQ?ID?NO：8、SEQ?ID?NO：9、SEQ?ID?NO：10、SEQ?ID?NO：11、SEQ?ID?NO：12、SEQ?ID?NO：13、SEQ?ID?NO：14、SEQ?ID?NO：15、SEQ?ID?NO：16、SEQ?ID?NO：17、SEQ?ID?NO：18、SEQ?ID?NO：19或SEQ?ID?NO：20。

具體的，所述SEQ?ID?NO：1為：5’-TGCGTGTTTACGTGTCGATGTCCGGGTACCCTCGG-3’；

所述SEQ?ID?NO：2為：5’-CTCTTAGCCATTTTGGTATGCGTATTGCTCTACAG-3’；