[發(fā)明專利]一種全人源抗TLR4的抗體Fab及其全分子抗體IgG和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410765623.8
• 申請日: 2014-12-12
• 公開（公告）號: CN104403001B
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐奇;熊四平;朱進(jìn);馮振卿;汪茂榮
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C12N15/13;A61K39/395;A61P29/00
• 代理公司: 北京精金石專利代理事務(wù)所(普通合伙)11470
• 代理人: 強(qiáng)紅剛

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因重組抗體藥物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種全人源抗TLR4的抗體Fab及其全分子抗體IgG，以及其在制備阻斷炎癥反應(yīng)藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

感染性休克亦稱膿毒性休克,或中毒性休克，是指由微生物及其毒素等產(chǎn)物所引起的膿毒病綜合征伴休克。感染灶中的微生物及其毒素、胞壁產(chǎn)物等侵入血循環(huán)，激活宿主的各種細(xì)胞和體液系統(tǒng)，產(chǎn)生細(xì)胞因子和內(nèi)源性介質(zhì)，作用于機(jī)體各種器官、系統(tǒng)，影響其灌注，導(dǎo)致組織細(xì)胞缺血缺氧、代謝紊亂、功能障礙，甚至多器官功能衰竭。其特點(diǎn)是病情重、進(jìn)展快、死亡率高。

感染性休克最重要的發(fā)病機(jī)制主要與感染的細(xì)菌及其內(nèi)毒素引起的一系列炎癥因子有關(guān)。內(nèi)毒素血癥可引起發(fā)熱反應(yīng),內(nèi)毒素直接作用于下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，或作用于白細(xì)胞使之釋放內(nèi)原性致熱原；促使血管活性物質(zhì)如緩激肽、組胺、5-羥色胺、血管緊張素等釋放，使血壓下降，導(dǎo)致微循環(huán)障礙；引起白細(xì)胞和血小板減少，激活凝血、纖溶系統(tǒng)，產(chǎn)生出血傾向；彌漫性血管內(nèi)凝血；經(jīng)C3旁路或經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體；直接或間接損害肝臟，引起糖代謝紊亂及酶學(xué)、蛋白代謝的改變；激活白三烯、前列腺素、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞活性。

脂多糖是細(xì)菌內(nèi)毒素(endotoxin)的主要成分，是革蘭氏陰性細(xì)菌胞壁的成分。內(nèi)毒素有多種生物活性，進(jìn)入人體血液可造成內(nèi)毒素血癥(ETM)，可引起多種病理生理過程變化如發(fā)熱、休克、彌漫性血管內(nèi)凝血和粒細(xì)胞減少等，甚至造成嚴(yán)重后果如呼吸窘迫綜合癥(ARDS)，急性腎衰竭(ARF)，甚至多器官功能衰竭等多種疾病，最終可因內(nèi)毒素休克死亡。

TLR4(Toll-like receptor 4,TLR4)是Toll樣受體家族的成員之一，也是一種模式識別受體，能夠識別微生物進(jìn)化過程中的一些保守結(jié)構(gòu)PAMP(pathogen-associatedmolecular pattern,PAMP)，如LPS，被認(rèn)為是內(nèi)毒素激活炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵。TLR4在體內(nèi)和體外對LPS效應(yīng)起著主要感受器的作用，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的促炎癥因子表達(dá)和組織對損傷的炎癥反應(yīng)。近年來，對LPS的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與TLR4的關(guān)系的研究取得了重大進(jìn)展。TLR4屬于Ⅰ型跨膜受體蛋白；胞外區(qū)由富含亮氨酸的重復(fù)序列LRR組成，胞內(nèi)區(qū)與IL-1受體胞內(nèi)區(qū)相似，稱為TIR(Toll/IL-1receptor)區(qū)。TLR4廣泛表達(dá)在各種淋巴細(xì)胞表面，其中既包括非特異免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中型粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞，又包括介導(dǎo)特異免疫反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，活化TLR4將誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列的炎癥介質(zhì)，從而產(chǎn)生強(qiáng)有力的炎癥反應(yīng)。LPS在細(xì)胞外被識別后導(dǎo)致TLR4受體寡聚化激活,將LPS刺激信號向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo),通過MyD88依賴和非MyD88依賴的2條途徑觸發(fā)一系列的信號激聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)NF-κB、AP-1和IRF-3等轉(zhuǎn)錄因子磷酸化和核轉(zhuǎn)位，上調(diào)TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和IFN-γ等細(xì)胞因子的表達(dá),最后啟動炎癥反應(yīng)。TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在這一過程中起著極其重要的作用，可能會成為治療內(nèi)毒素血癥的重要靶點(diǎn)。

目前，研究人員普遍認(rèn)為TLR4是內(nèi)毒素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的瓶頸和內(nèi)毒素瀑布效應(yīng)的限速步驟，阻斷TLR4對內(nèi)毒素信號的傳導(dǎo)，是控制內(nèi)毒素生物效應(yīng)的最為有效的手段。雖然現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道了對TLR4進(jìn)行的相關(guān)研究，但是尚無開發(fā)出針對人源TLR4的抗體，從而不能有效控制內(nèi)毒素的生物效應(yīng)，因此對于TLR4介導(dǎo)的各種炎癥反應(yīng)，沒有得到十分有效的控制。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明目的在于提供一種全人源抗TLR4的抗體Fab及其全分子抗體IgG，以及該抗體CDR區(qū)域的核苷酸及氨基酸序列、抗體可變區(qū)核苷酸及氨基酸序列，及其在抑制TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的用途。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過大量試驗(yàn)研究，包括全人源免疫型Fab噬菌體抗體庫的構(gòu)建，抗TLR4特異性抗體的篩選、純化，抗TLR4全分子抗體IgG的制備、表達(dá)及純化，抗TLR4全分子抗體IgG的特性分析，抗TLR4全分子抗體IgG對TNF-α表達(dá)的影響，最終獲得了如下技術(shù)方案：

一種全人源抗TLR4的抗體Fab，包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中：

(1)所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是該序列經(jīng)一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體；