[發明專利]一種共表達羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶的大腸桿菌系統的構建

在審

• 申請號: 201410758942.6
• 申請日: 2014-12-10
• 公開（公告）號: CN104388373A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;朱利娟;吳芹;李劍芳;張鵬;何瑤
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/02;C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12R1/19
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技術領域

本發明涉及一種共表達羰基還原酶基因(Sys1)和葡萄糖脫氫酶基因(Sygdh)的重組大腸桿菌系統的構建，屬于生物工程技術領域。

背景技術

手性醇即含有手性醇羥基的一類化合物，在手性藥物、香料、農藥等物質的合成方面有著重要的作用，如(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇((R)-CCE)是一種重要的手性化合物，是合成多種β3-腎上腺素能受體(AR)激動劑(SR-58611A、TAK-677)的重要手性中間體。近年來有關(R)-CCE的合成一直是國內外的熱點，該類化合物的制備方法主要包括化學法和生物法，而每種方法又有拆分法和合成法。拆分法的缺點是最大收率不超過50％；化學合成法的收率在70～90％，對映體過量(e.e.)值50～80％，但其所用催化劑價格昂貴，產物的光學純度不高，后期金屬離子的去除不理想，且藥物中對于金屬離子的嚴格要求都限制著化學合成。生物催化法具有高效性，高立體選擇性，反應條件溫和等優點，近年來受到廣大研究者的青睞。利用羰基還原酶不對稱還原3-氯苯甲酰甲基氯(m-CPC)，將潛手性的底物m-CPC轉化成具有手性的(R)-CCE，有產率高和e.e.值大等優勢。但是生物催化羰基的不對稱還原反應除了在氧化還原酶作用下進行，還需輔酶NAD(P)H參與。輔酶可以通過底物偶聯或酶偶聯的方法再生。底物偶聯法是在反應過程中添加輔助底物，在相同酶的作用下實現目標底物和輔助底物的同時轉化，但兩者的方向相反。酶偶聯法是利用兩個獨立的氧化還原體系進行反應。

最近報道了一種木蘭假絲酵母(Candida?magnoliae)的羰基還原酶基因(s1)，其編碼的羰基還原酶(S1)被發現可催化溴代苯乙酮衍生物生成相應鹵代醇，但沒有關于利用羰基還原酶S1還原m-CPC的相關研究和報道。本專利的工作是將其羰基還原酶基因(s1)根據大腸桿菌密碼子的偏愛性進行密碼子優化并人工合成其基因，命名為Sys1。為解決輔酶再生問題，利用合成基因Sys1相同的方法將嗜酸熱源體(Thermoplasma?acidophilum)中的葡萄糖脫氫酶基因(gdh)進行優化和合成并命名為Sygdh。將二者構建在含有雙啟動子的質粒pETDuet-1中，并在大腸桿菌BL21(DE3)表達，即E.coli?BL21(pETDuet-Sygdh-Sys1)是一種單菌共表達雙酶偶聯的體系，可解決生物催化中輔酶的再生問題。

發明內容

本發明的目的是構建一種共表達羰基還原酶基因和葡萄糖脫氫酶基因的重組大腸桿菌。

本發明的技術方案：

一種新型的共表達羰基還原酶基因和葡萄糖脫氫酶基因的大腸桿菌工程菌是指導入了密碼子優化后的木蘭假絲酵母(Candida?magnoliae)的羰基還原酶基因(s1)和嗜酸熱源體(Thermoplasma?acidophilum)的葡萄糖脫氫酶基因(gdh)的重組大腸桿菌。

所述的木蘭假絲酵母(Candida?magnoliae)的羰基還原酶基因(s1)含有852bp堿基，其在GeneBank登錄號為AB036927，對其進行密碼子優化并命名為Sys1。優化后的基因序列Sys1含有852bp堿基且已提交至GenBank數據庫，登錄號為KJ522844，其基因序如SEQ?ID?NO:1所示。由該基因編碼的羰基還原酶包含283個氨基酸，其GenBank登錄號為AHZ34231，其氨基酸序如SEQ?ID?NO:2。

所述的嗜酸熱源體(Thermoplasma?acidophilum)的葡萄糖脫氫酶基因(gdh)含有1086bp堿基，其在GeneBank登錄號為CAC12026，對其進行密碼子優化并命名為Sygdh。優化后的基因序列Sygdh含有1086bp堿基且已提交至GeneBank數據庫，登錄號為KF739810，其基因序列入SEQ?ID?NO:3所示。由該基因編碼的葡萄糖脫氫酶包含361個氨基酸，其GeneBank登錄號為AHF81466，其氨基酸序如SEQ?ID?NO:4。

所述重組大腸桿菌的構建方法(見圖1)為：人工合成羰基還原酶基因Sys1和葡萄糖脫氫酶基因Sygdh，構建雙酶耦合表達載體，并在大腸桿菌中實現共表達，重組蛋白用SDS-PAGE分析(見圖2)。

所述的羰基還原酶(SyS1)和葡萄糖脫氫酶(SyGDH)的活性測定方法：