[發明專利]耐熱木聚糖酶(Xyl11^M)基因的合成及其在畢赤酵母中的表達無效

申請號：	201410758941.1	申請日：	2014-12-10
公開（公告）號：	CN104388451A	公開（公告）日：	2015-03-04
發明（設計）人：	鄔敏辰;姚瑤;吳芹;李劍芳;李興倩;張鵬	申請（專利權）人：	江南大學
主分類號：	C12N15/56	分類號：	C12N15/56;C12N9/42;C12N15/81;C12R1/84
代理公司：	暫無信息	代理人：	暫無信息
地址：	214122 江蘇***	國省代碼：	江蘇;32
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摘要：
搜索關鍵詞：	耐熱聚糖 xyl11 sup 基因合成及其酵母中的表達
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【權利要求書】：

1.一種來源于嗜熱裂孢菌(Thermobifida?fusca)的耐熱β-1,4-內切木聚糖酶(Xyl11^M)的優化基因(xyl11^M)，其對應的核苷酸序列和蛋白質序列分別為：SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2。

2.Xyl11^M的異源表達、活性及酶學性質的測定：

(1)重組質粒pUCm-T-xyl11^M的構建：參照畢赤酵母密碼子偏好性表對來源于嗜熱裂孢菌的耐熱木聚糖酶催化域基因中的稀有密碼子進行優化，并在其催化域基因兩端分別加入EcoR?Ⅰ、Not?Ⅰ位點，該基因命名為xyl11^M，人工合成后克隆至pUCm-T質粒，轉化E.coli?JM109，藍白斑篩選陽性轉化子，送上海生工測序，獲得重組質粒pUCm-T-xyl11^M；

(2)重組表達質粒的構建：將上述得到的重組質粒pUCm-T-xyl11^M進行EcoR?Ⅰ和Not?Ⅰ雙酶切，割膠回收產物與經同樣雙酶切的表達質粒pPIC9K連接，轉化E.coli?DH5α感受態細胞，經PCR篩選鑒定后送上海生工測序，獲得重組質粒pPIC9K-xyl11^M；

(3)GS115/xyl11^M重組子的構建、表達及酶學性質的測定：pPIC9K-xyl11^M質粒經Sal?Ⅰ線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/xyl11^M；該工程菌用1.0％甲醇誘導72h，離心后上清液為重組木聚糖酶粗酶液，DNS法測得粗酶液中重組木聚糖酶活性達157U/mL；該酶的最適反應溫度為70℃，在70℃處理60min后，殘留酶活性為98％；其最適pH為6.0，在pH?5.0～8.0的范圍內較穩定；金屬離子和EDTA對其影響較小。

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