[發(fā)明專利]生產(chǎn)聚羥基丁酸－戊酸酯的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410758183.3
• 申請日: 2014-12-10
• 公開（公告）號(hào): CN104450594A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁久元;張英姿;劉桂明;翁維琦;劉雙江
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/74;C12P7/62;C12R1/01
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;陳曉慶

1.重組菌，包括將甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶的編碼基因yliK、GTP激酶的編碼基因argK和甲基丙二酸單酰輔酶A脫羧酶的編碼基因ygfG導(dǎo)入宿主真氧羅氏菌Ralstonia?eutropha，得到所述重組菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于：所述宿主真氧羅氏菌為真氧羅氏菌Rem-1或真氧羅氏菌Rem-3或真氧羅氏菌Rem-5或真氧羅氏菌Rem-7；

所述Rem-3是真氧羅氏菌Rem-1缺失2-甲基檸檬酸合酶-1基因prpC1后得到的菌；

所述Rem-5是真氧羅氏菌Rem-1缺失2-甲基檸檬酸合酶-2基因prpC2后得到的菌；

所述Rem-7是真氧羅氏菌Rem-1缺失所述2-甲基檸檬酸合酶-1基因prpC1和所述2-甲基檸檬酸合酶-2基因prpC2后得到的菌；

所述2-甲基檸檬酸合酶-1的氨基酸序列如序列表中序列2所示；

所述2-甲基檸檬酸合酶-2的氨基酸序列如序列表中序列5所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組菌，其特征在于：所述甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶的編碼基因yliK、所述GTP激酶的編碼基因argK和所述甲基丙二酸單酰輔酶A脫羧酶的編碼基因ygfG通過重組表達(dá)載體pZMwf導(dǎo)入所述宿主真氧羅氏菌；

所述重組表達(dá)載體pZMwf的構(gòu)建方法包括如下步驟：將如序列表中序列7所示的yliK-argK-ygfG基因簇片段插入表達(dá)載體pLXM1的多克隆位點(diǎn)中，得到的重組載體記作pZMwf；

所述甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶的氨基酸序列如序列表中序列8所示；

所述GTP激酶的氨基酸序列如序列表中序列9所示；

所述甲基丙二酸單酰輔酶A脫羧酶的氨基酸序列如序列表中序列10所示。

4.含有甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶的編碼基因yliK、GTP激酶的編碼基因argK和甲基丙二酸單酰輔酶A脫羧酶的編碼基因ygfG的重組表達(dá)載體；

所述甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶的氨基酸序列如序列表中序列8所示；

所述GTP激酶的氨基酸序列如序列表中序列9所示；

所述甲基丙二酸單酰輔酶A脫羧酶的氨基酸序列如序列表中序列10所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于：所述重組表達(dá)載體是將含有yliK-argK-ygfG基因簇片段插入表達(dá)載體pLXM1的多克隆位點(diǎn)中得到的。

6.權(quán)利要求2所述的Rem-3或權(quán)利要求2所述的Rem-5或權(quán)利要求2所述的Rem-7。

7.權(quán)利要求1-3任一所述的重組菌或權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體或權(quán)利要求6所述的Rem-3或Rem-5或Rem-7在生產(chǎn)聚羥基丁酸－戊酸酯中的應(yīng)用。

8.權(quán)利要求1-3任一所述的重組菌或權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體或權(quán)利要求6所述的Rem-3或Rem-5或Rem-7在提高菌株合成PHBV中3HV組分含量中的應(yīng)用。

9.一種生產(chǎn)聚羥基丁酸－戊酸酯的方法，包括如下步驟：以葡萄糖為底物，發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求1-3任一所述的重組菌或權(quán)利要求6所述的Rem-3或Rem-5或Rem-7，得到所述聚羥基丁酸－戊酸酯。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基中不含有丙酸或丙酸鹽或戊酸或戊酸鹽。