[發明專利]一種添加二硫鍵以提高阿魏酸酯酶A熱穩定性的方法

有效

• 申請號: 201410758084.5
• 申請日: 2014-12-10
• 公開（公告）號: CN104531729A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;殷欣;余濤;李劍芳;姚瑤;何瑤
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/18;C12N15/66;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明涉及宇佐美曲霉(Aspergillus?usamii)E001菌株阿魏酸酯酶A(AuFaeA)基因的熱穩定性改造，突變阿魏酸酯酶A工程菌的構建及重組突變阿魏酸酯酶A的高效表達，屬于生物工程技術領域。

背景技術

阿魏酸酯酶(EC?3.1.1.73)又稱肉桂酸酯酶，是羧酸水解酶的一個亞類，屬于胞外酶，能打斷半纖維素之間的、半纖維素與木質素之間交聯的酯鍵，是半纖維素降解酶系的組成成分之一。自1991年Faulds等首次分離出阿魏酸酯酶以來，已有超過30種阿魏酸酯酶被克隆、表達及純化，其主要生物功能是水解植物細胞壁中多糖與阿魏酸連結的酯鍵，釋放出游離的單體阿魏酸或阿魏酸二聚體。但研究結果表明，天然阿魏酸酯酶的熱穩定性一般較差，成為其在食品加工、飼料(制粒)、造紙行業(紙漿漂白)等諸多領域中應用的瓶頸。

由于高溫生物工程環境限制了阿魏酸酯酶的應用，所以人們加強了對酶熱穩定性的研究。希望可以通過提高酶作用溫度和增加酶熱穩定性，從而提高酶作用效率，以達到降低工業生產成本的目的。目前，開發耐熱型阿魏酸酯酶的研究主要包括篩選自然界中超耐熱的阿魏酸酯酶生產菌和利用蛋白質工程技術等對酶分子進行定向改造，相對于篩菌技術的盲目性，后者具有更強的針對性，受到國內外學者的青睞。隨著基因工程技術、生物信息學等的快速發展，為分子生物學的研究開辟了新的道路。通過運用大規模高性能的計算機及其相關軟件，結合基因工程手段，利用模擬試驗對酶分子進行定向改造以提高熱穩定性，從而擴大阿魏酸酯酶的應用面。

發明內容

本發明的目的是提供一種阿魏酸酯酶A熱穩定性改造、突變阿魏酸酯酶A工程菌構建以及突變阿魏酸酯酶A高效異源表達的方法。

本發明的技術方案：根據來源于A.usamii?E001阿魏酸酯酶A(AuFaeA)的空間結構設計突變A126C和N152C，得到突變阿魏酸酯酶A：AuFaeA^A126C-N152C，其成熟肽基因AufaeA^A126C-N152C序列為SEQ?ID?NO:1，C126和C152可以形成二硫鍵。

所述的由成熟肽基因編碼得到的AuFaeA^A126C-N152C氨基酸序列為SEQ?ID?NO:2。

所述的重組阿魏酸酯酶A的活性測定方法：

以阿魏酸甲酯(MFA)為底物，高效液相(HPLC)分析阿魏酸的釋放量。具體操作為：移取900μL?MFA(1mM，pH?6.0)于2mL?EP管中，45℃保溫10min，加入100μL適當稀釋的酶液，反應10min后加入400μL冰乙酸終止反應，立即混勻進行高效液相分析。以先在酶溶液中加入400μL冰乙酸，再加底物溶液為對照。色譜條件：以甲醇、1％乙酸一步梯度洗脫，在10min內，甲醇濃度由50％上升至80％，流速1mL/min，柱溫30℃，檢測波長320nm，上樣量20μL。根據峰面積，從標準曲線查出相應的阿魏酸量，從而計算酶活。酶活單位定義：在測定條件下(45℃、pH?6.0)每分鐘產生1μmol阿魏酸所需的酶量為一個酶活單位(U)。

所述的突變阿魏酸酯酶A基因的設計、克隆及表達：

(1)氨基酸殘基突變位點的選定：以黑曲霉阿魏酸酯酶A的三維結構(1UWC)為模板，用Modeller?9.9軟件模擬出AuFaeA的三維結構。利用Discovery?Studio?3.0Client、PyMOL和Disulfide?By?Design軟件對模擬的三維結構進行分析，并用gromacs-4.5程序包對改造前后的三維結構進行動力學模擬，最終確定氨基酸殘基突變位點。

(2)突變基因AufaeA^A126C-N152C及其表達質粒的構建：根據已申請發明專利(申請號：201210181372.X)中核苷酸序列及突變位點特點設計突變引物126-F，152-R：

126-F：5’-ATCCGGACTATTGCCTTACCGTGACA-3’，

152-R：5’-GTACAGACGGACGCAGTCATATGTCGC-3’，