[發明專利]測定細胞α-丁酸萘酚酯酶的檢測芯片及其試劑

在審

• 申請號: 201410758074.1
• 申請日: 2014-12-11
• 公開（公告）號: CN104611190A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發明（設計）人: 孫續國;孫朝;趙鵬;宋林;鄭芳;趙萌;劉金平;張錦仁
• 申請（專利權）人: 天津祿浩科技有限公司
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00;C12Q1/44
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及利用細胞芯片技術測定細胞α-醋酸萘酯酶活性，用于單核細胞與其他細胞的鑒別，同時為粒細胞血液疾病的個體化治療提供生物信息。體現在本發明設計了一種細胞微流控捕通道和巢式捕獲細胞的微芯片結構，同時含有能夠與α-醋酸萘酯酶作用，適合芯片檢測的試劑，用于細胞α-醋酸萘酯酶檢測。

技術背景

細胞芯片是以細胞作為研究對象的一種生物芯片技術，它是為適應基因、分子時代對于探索生命科學需求而產生的新興技術。細胞芯片即保持傳統研究細胞方法的優點如又滿足了高通量、大樣本及快速獲取細胞信息等特點。可用于研究特定基因及表達蛋白質與疾病之間的相互關系，對于疾病診斷、藥物治療靶點篩選、細胞定位、抗體藥物篩選等方面有廣泛的應用價值。

單核細胞可以表達α-醋酸萘酯酶，表達的α-醋酸萘酯酶與單核細胞的生理功能有關。測定α-醋酸萘酯酶的方法有底物顯色法、抗α-醋酸萘酯酶抗體免疫標記法和α-醋酸萘酯酶染色法，而這些方法只能夠測整體總量或者對于細胞的α-丁酸萘酚酯酶進行定位，不能夠同時分別測定單核細胞內表達α-醋酸萘酯酶的活性。由于血液中存在10余種細胞，而骨髓中存在60余種類型細胞，能夠測定不同類型細胞α-醋酸萘酯酶具有臨床意義。

2002年7月17日公開，授予樓屹的《快速檢測腎臟損害的尿蛋白質芯片》專利號CN1359004A，公布了一種快速檢測腎臟損害的尿蛋白質芯片的測定方法，它由載體盒面板、載體盒背板和蛋白質試紙條組成，所述的面板下端為進樣口、中部為觀察口以及進樣口和觀察口之間的控樣線，所述載體盒背板內有扇形排列的四個載體槽，載體槽內分別放置檢測白蛋白(ALB)、轉鐵蛋白(TF)、視黃醇結合蛋白(RBP)和尿NAG的尿蛋白試紙條，利用芯片技術集成化、高通量、并行的原理，將這些蛋白試紙條以平行或扇形方式任意組合，集成在一起，形成尿蛋白芯片，他能夠一次性同時檢測尿液中這四種蛋白。由于判定結果敏感度有限，本法測定結果只能夠達到半定量。

α-醋酸萘酚酯酶(α-naphthol?acetate?esterase，α-NAE)可表達于分化成熟的單核細胞，利用α-乙酸萘酚經酯酶水解產生萘酚，萘酚與重氮鹽偶聯生成灰黑或棕黑色沉淀物，可輔助鑒別單核細胞、中性粒細胞等。細胞染；單核細胞和組織細胞呈強陽性，可被氟化鈉抑制；巨核細胞及血小板呈陽性；早幼粒細胞白血病時早幼粒細胞可陽性，而粒細胞和淋巴細胞為陰性，主要用于鑒別急性單核細胞性白血病與急性粒細胞性白血病，前者NSE陽性，受氟化鈉(NaF)抑制；而后者NSE陰性，若有陽性也不受氟化鈉抑制。

在2013年4月24日公開的黃曉波等發明專利《一種細胞微陣列芯片及其制備方法》，公開專利號CN103060175A，本專利公開了一種細胞微陣列芯片及其制備方法屬于細胞芯片技術領域。其特征是由海藻酸凝膠制備的海藻酸凝膠細胞微陣列芯片，操作簡便，可用于細胞組織化培養、化合物或藥物的高通量篩選、新基因的發現、以及蛋白質組學研究等。制備方法是：(1)在玻璃板上涂敷一層海藻酸鈉溶液，快速浸入氯化鈣溶液中，浸泡5～30分鐘形成凝膠模板。(2)制備一個上面排布有多個圓柱體的點陣模板，將圓柱體頂端浸泡在殼聚糖或聚賴氨酸溶液中5～30分鐘后取出。(3)將圓柱體頂端壓印在海藻酸凝膠模板上，通過靜電絡合反應形成絡合物點陣模板。(3)將絡合物點陣模板浸泡在細胞濃度為1×10⁵～1×10⁷的培養液中培養4～16小時，形成海藻酸凝膠細胞微陣列芯片。

本發明的目的在于提供了一種細胞α-醋酸萘酯酶檢測芯片及其測定試劑，可有效的克服以前芯片能夠測定細胞生物性過程中不能夠有效測定特定細胞類型表達生物信息的缺點。

發明內容

本發明解決的技術問題是克服了在利用芯片技術測定細胞α-醋酸萘酯酶過程中由于體液細胞類型復雜難以準確測定細胞表達α-醋酸萘酯酶活性。發明提出解決上述技術問題采用的技術方案是：發明試劑包括A：微流控溶液，100mmol/L?pH?7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)；B：基質溶液，10-100mmol/L?α-醋酸萘酯丙酮液；C：混合溶液，基質液：磷酸鹽緩沖液的比例為18ml∶82ml；D：61％氟化鈉基質液。

本發明試劑能夠有利于與細胞α-醋酸萘酯酶作用。上述試劑類型限定為三種，另外限定試劑輸入的比例，測定過程中，A與C和D三種溶液混合按照一定比例輸入，其比例為試劑A、C、D的混合液為50∶1∶1的比例進行輸入。整體試劑輸入速度為200ul-800ul/min。