[發明專利]一種N端替換提高米曲霉木聚糖酶(AoXyn11A)熱穩定性的方法

有效

• 申請號: 201410757519.4
• 申請日: 2014-12-10
• 公開（公告）號: CN104388412B
• 公開（公告）日: 2017-10-31
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;何瑤;殷欣;李劍芳;姚瑤;吳芹
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/81;C12R1/69
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司23211
• 代理人: 彭素琴

技術領域

常溫木聚糖酶(AoXyn11A)源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株。本發明涉及一種耐熱雜合木聚糖酶的理性設計及雜合木聚糖酶基因的構建和表達的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

內切β-1,4-D-木聚糖酶簡稱木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是一種重要的工業用酶。它作用于木聚糖的主鏈，隨機切割木聚糖內部的β-1,4糖苷鍵，水解產物主要為不同聚合度的木寡糖和少量木糖，是木聚糖降解酶系中最關鍵的酶。近年來，由于木聚糖酶在造紙、飼料、食品和釀造等工業領域具有潛在的應用價值，尤其是在造紙工業中的應用，可減少因化學物質漂白產生的環境污染，受到了越來越多的關注。然而在許多應用領域中，木聚糖酶需要在高溫條件下使用，因此對木聚糖酶熱穩定性研究和耐熱酶制備已引起了國內外研究者的高度重視。目前主要采用兩種途徑獲取耐熱木聚糖酶：一是從自然界中篩選產耐熱酶的菌株，二是利用基因工程技術對常溫酶進行耐熱性改造。

依據對酶催化域一級和空間結構的比對和疏水簇分析，絕大多數木聚糖酶歸屬糖苷水解酶10和11家族。由于11家族木聚糖酶分子量較小，且結構相對簡單，較適合作為理論研究的分子模型，用于極端條件下木聚糖酶催化模式和蛋白分子折疊機理等的研究。隨著分子生物學、生物信息學及計算機科學的快速發展，為酶蛋白分子的改造開辟了新的途徑。本發明運用計算機及其相關生物學軟件，將生物信息學分析與分子生物學操作相結合，定向改造AoXyn11A以提高其熱穩定性，拓展該木聚糖酶的應用領域。

發明內容

本發明的目的是提供一種耐熱雜合木聚糖酶的理性設計以及雜合木聚糖酶基因的構建和表達的方法。

本發明的技術方案：首先借助高性能計算機及其相關生物學軟件對源自A.oryzae CICC 40186的11家族常溫木聚糖酶AoXyn11A的耐熱性改造進行理性設計；然后將AoXyn11A N端41個氨基酸替換成同一家族耐熱木聚糖酶TfGH11(PDB:3ZSE)N端42個氨基酸，得到一種耐熱雜合木聚糖酶，命名為ATX11A，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。該雜合酶基因由AoXyn11A和TfGH11編碼基因的相應片段拼接而成，命名為ATx11A，其核苷酸序列為SEQID NO:2。

所述的AoXyn11A基因Aoxyn11A克隆自A.oryzae菌株(購自中國工業微生物菌種保藏中心，編號為CICC 40186)；重組克隆質粒pUCm-T-Aoxyn11A(已公開，GenBank accession No.JQ326257)由江南大學構建和保藏。

所述的木聚糖酶基因xyn11PM是基于耐熱TfGH11催化域基因序列(GenBank accession No.AY795559)并參照畢赤酵母(Pichia pastoris)密碼子偏愛性由人工合成的；重組克隆質粒pUCm-T-xyn11PM由江南大學構建和保藏。

木聚糖酶活性的測定：于25mL具塞試管A和B中各加入用pH 5.5、檸檬酸–Na₂HPO₄緩沖液配制的0.5％(w/v)樺木木聚糖溶液2.4mL，50℃預熱10min，在A管中加入0.1mL適當稀釋的酶液，50℃準確反應15min；立即各加入2.5mL DNS試劑，在B管中補加0.1mL酶液，煮沸7min；冷卻后各加入去離子水5mL，混勻；540nm處以B管為對照測定A管吸光度值，從木糖標準曲線上查出相應的還原糖(以木糖計)含量。在本測定條件下，每分鐘產生1μmol還原糖的酶量定義為1個木聚糖酶活性單位(U)。

耐熱雜合木聚糖酶ATX11A的理性設計、ATx11A的構建和表達：

(1)木聚糖酶空間結構的同源建模：以常溫木聚糖酶AoXyn11A序列為模板，在GenBank數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中運用BLAST服務器進行木聚糖酶序列搜尋和同源比對，找到了與AoXyn11A序列高度同源的耐熱酶TfGH11。以TfGH11已知晶體結構(PDB:3ZSE)為模板，運用SWISS-MODEL在線程序(http://swiss-model.expasy.org/on-line)分別對AoXyn11A和各種擬雜合酶進行同源建模。運用軟件Verify_3D對同源建模的各結構模型進行評估和優化。