[發明專利]轉基因玉米的多重PCR篩查檢測引物及檢測方法

有效

• 申請號: 201410756727.2
• 申請日: 2014-12-11
• 公開（公告）號: CN104404161A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發明（設計）人: 尹全;宋君;劉勇;雷紹榮;郭靈安;王東;張富麗;劉文娟;常麗娟
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院分析測試中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 成都頂峰專利事務所(普通合伙) 51224
• 代理人: 楊俊華

技術領域

?本發明屬于生物技術領域，涉及一種可同時檢測兩種和六種外源基因的多重PCR篩查檢測方法。

背景技術

目前關于進口轉基因玉米及其產品的篩查檢測技術，主要集中在單一基因PCR方法，尚無關于檢測進口轉基因玉米及其產品的多重PCR篩查檢測策略研究及相關篩查檢測技術。

發明內容

本發明的目的主要是提供一種準確、快速、簡便的多重PCR快速篩查多個目的基因元件的檢測方法。

本發明通過下述技術方案實現：

轉基因玉米的多重PCR篩查檢測引物，包括以下引物序列：

其中，二重PCR引物序列如下：

P-CaMV?35S-F：5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'；

P-CaMV?35S-R：5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3'；

T-NOS-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3'；

T-NOS-R：5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'。

六重PCR引物序列如下：

P-ract1-F：5'-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3'；

P-ract1-R：5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT-3'；

T-NOS-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3'；

T-NOS-R：5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'；

P-CaMV?35S-F：5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'；

P-CaMV?35S-R：5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3'；

bar-F：5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3'；

bar-R：5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3'；

pat-F：5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3'；

pat-R：5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3'；

PMI-F：5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3'；

PMI-R：5'-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3'。

上述二重PCR檢測方法如下：

（a1）合成以下引物：

P-CaMV?35S-F：5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'；

P-CaMV?35S-R：5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3'；

T-NOS-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3'；

T-NOS-R：5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'；

（a2）制備待測玉米的DNA稀釋液；

（a3）配制PCR反應體系；

（a4）進行PCR反應；

（a5）取PCR反應產物進行毛細管電泳。

進一步地，步驟（a3）中所述的配制PCR反應體系總體積為25μL；具體含以下組分：PCR?Master?Mix（2X）、DNA稀釋液、步驟（a1）中的各引物、ddH₂O；其中PCR?Master?Mix（2X）的加入量為12.5μL，DNA稀釋液加入量為2.0μL，各引物加入后的終濃度均為0.2μM，采用ddH₂O補足25μL。

再進一步地，所述PCR反應條件為：94℃變性5min，然后進入35個循環；94℃30s，58℃30s，72℃30s；循環結束后72℃延伸5min。

上述六重PCR檢測方法如下：

（b1）合成以下引物：

P-ract1-F：5'-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3'；

P-ract1-R：5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT?-3'；

T-NOS-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3'；

T-NOS-R：5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'；

P-CaMV?35S-F：5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'；

P-CaMV?35S-R：5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3'；