[發明專利]一組微孢子蟲分子通用檢測引物及其試劑盒

有效

• 申請號: 201410755669.1
• 申請日: 2014-12-11
• 公開（公告）號: CN104498599A
• 公開（公告）日: 2015-04-08
• 發明（設計）人: 劉吉平;宋小景;程偉
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

技術領域

?本發明屬于昆蟲病原微生物分子檢測技術領域。更具體地，涉及一組微孢子蟲分子通用檢測引物及其試劑盒。

背景技術

蠶微粒子病的研究始于1845年發生在法國的全國流行微粒子病，巴斯德確定他觀察到的“微粒”是微粒子病的成因因素，其病原包括家蠶微孢子蟲和柞蠶微孢子蟲等微孢子蟲病原物。尤其是家蠶微孢子蟲有水平傳播和垂直傳播兩種傳染途徑，其中垂直傳播對蠶業生產中的蠶種生產造成巨大的危害，同時對絲繭育蠶繭產量和品質帶來很大的負面影響，嚴重影響蠶絲產業鏈下游經濟的發展（蔡順風等，2011）。自法國全國微粒子病爆發以來，家蠶微孢子蟲始終是各國蠶種生產和進出口貿易的重要檢測對象。19世紀末，在日本養蠶業最發達的時期，《母蛾鏡檢法》、《蠶病預防法》曾被寫入憲法（Takeshi?Kawarabata，2003），我國也將其列為進出口動物檢疫二類疫病［《中華人民共和國進境動物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》，（1992）農（檢疫）字第12?號］。

最初人們判別微孢子蟲主要根據微粒子病的發病特點進行肉眼觀察。顯微鏡發明以后，人們根據微孢子蟲的形態和大小進行顯微鏡鏡檢，一定程度上提高了檢測的靈敏度和效率，并因此遏制了法國全國流行的微粒子病。但是顯微鏡鏡檢有明顯的缺點，如對操作人員的技術及經驗要求較高，而且微孢子蟲個體及其微小，常用的顯微鏡鏡檢檢測方法特異性和靈敏度較低，難以區分微孢子蟲類似物。

隨著PCR技術的普及，人們開始使用PCR方法來檢測微孢子蟲并且達到了較高的靈敏度。“分子鐘”是分子水平分析生物系統進化中的有效手段，SSU?rRNA（16S?rDNA）是微生物進化研究中常用的“分子鐘”（Pei?A?Y,?et?al.,?2010）。家蠶微粒子病PCR檢測技術研究中所設計的引物針對的靶基因多數也是SSU?rRNA，針對其他微孢子蟲基因設計的引物較少或靈敏度較差，因而很少被報道。Baker?et?al（1995）和Terry?et?al（1999）根據相近種屬微孢子蟲SSU?rRNA高度保守區設計的PCR引物V1f/530r，可鑒別多種種屬的微孢子蟲的DNA模板擴增約450bp的特異目的條帶，但是靈敏性卻差強人意，而且本發明人研究發現，使用該引物檢測蠶卵微孢子蟲時，檢測的靈敏度極低，暗示蠶卵抽提物中可能存在某種抑制因素干擾了對家蠶微孢子蟲（N.b）DNA的PCR擴增。

而在實際工作中，尤其是檢疫工作，對于樣品的各種微孢子蟲病原的檢測是很重要的，且不能出現漏檢的情況，因此尋求一種既能夠通用的檢測多種微孢子蟲，又具有很好的檢測靈敏性，且以蠶卵DNA為模板時也具有很好的靈敏性的引物組，在微孢子蟲的實際檢測應用中具有廣泛的應用價值和意義。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有微孢子蟲通用檢測技術的不足，以家蠶微孢子蟲HMG1基因為靶基因設計檢測引物，提供一種結果可靠、易于操作（簡單快速）、靈敏度高的通用檢測多種微孢子蟲的方法。

本發明的目的是提供一種微孢子蟲分子通用檢測引物。

本發明另一目的是提供所述微孢子蟲分子通用檢測引物在制備微孢子蟲通用檢測試劑盒方面的應用。

本發明的再一目的是提供一種微孢子蟲通用檢測試劑盒。

本發明上述目的通過以下技術方案實現：

一組微孢子蟲通用檢測引物，所述通用檢測引物包括上游引物HMG1F和下游引物HMG1R，上游引物HMG1F的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，下游引物HMG1R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

本發明在獲得了家蠶微孢子蟲HMG1基因的基礎上（HMG1基因DNA全長核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其cDNA全長核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示），以HMG1基因為靶基因，設計了上述引物，該引物既能夠通用的檢測多種微孢子蟲，又具有很好的檢測靈敏性，在微孢子蟲的實際檢測應用中具有廣泛的應用價值和意義。所述引物尤其適用于同時檢測家蠶微孢子蟲、柞蠶微孢子蟲和玉米螟微孢子蟲。

本發明還提供了所述微孢子蟲通用檢測引物在制備微孢子蟲通用檢測試劑盒方面的應用。提供了一種微孢子蟲通用檢測試劑盒，包括上游引物HMG1F和下游引物HMG1R，上游引物HMG1F的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，下游引物HMG1R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

優選地，所述試劑盒的使用方法如下：