[發明專利]一種富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的紅蕓豆乳的制備方法

在審

• 申請號: 201410752899.2
• 申請日: 2014-12-10
• 公開（公告）號: CN104381465A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 徐娟;吳淵;鄧惟
• 申請（專利權）人: 杭州元佩特生物科技有限公司
• 主分類號: A23C11/10
• 分類號: A23C11/10;C12N15/03;C12N15/01
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

1.一種富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的紅蕓豆乳的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)、將產納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263分別進行亞硝基胍誘變；然后混合二者誘變后代，進行細胞融合傳代培養，高通量篩選得到高產納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌，命名為納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-206；

2)、將干酪乳桿菌進行亞硝基胍誘變，從中篩選出甲硫氨酸營養缺陷型的干酪乳桿菌，命名為干酪乳桿菌LcS-Met^-；

3)將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-206和干酪乳桿菌LcS-Met^-共發酵紅蕓豆汁，得到富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的紅蕓豆乳。

2.根據權利要求1所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的紅蕓豆乳的制備方法，其特征在于，步驟1)中，所述的高通量篩選具體包括：①制備2個平板豆芽汁紅蕓豆汁固體培養基，其中一個將小鼠抗PQQ?IgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個將瓊脂糖-纖維蛋白配入，形成平板B；②將納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變融合后代涂布其中一個平板后，再用纖維素膜影印至另一個平板，使平板A和平板B互為影印平板；③平板A中，高產吡咯喹啉醌的誘變融合后代菌落周圍形成肉眼可見沉淀圈，根據沉淀圈直徑大小可肉眼判斷產吡咯喹啉醌量大小；④平板B中，高產納豆激酶的誘變融合后代菌落周圍形成透明圈，根據透明圈直徑大小可肉眼判斷產納豆激酶活力高低；⑤平板A與平板B中，高產吡咯喹啉醌菌落與高產納豆激酶菌落處于同一位置者，即為高產納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌。

3.根據權利要求2所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的紅蕓豆乳的制備方法，其特征在于，步驟1)中，所述的平板豆芽汁紅蕓豆汁固體培養基以1L計，由以下量的組分組成：

4.根據權利要求1所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的紅蕓豆乳的制備方法，其特征在于，步驟2)中，所述的從中篩選出甲硫氨酸營養缺陷型的干酪乳桿菌，具體包括：①制備2個平板MRS固體培養基，其中一個將甲硫氨酸配入，為平板C，另一個為單純MRS固體培養基平板，為平板D；②將誘變后的干酪乳桿菌涂布其中一個平板后，再用纖維素膜影印至另一個平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出現菌落而平板D未出現菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落為甲硫氨酸營養缺陷型干酪乳桿菌。

5.根據權利要求4所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的紅蕓豆乳的制備方法，其特征在于，步驟2)中，所述的平板MRS固體培養基以1L計，由以下量的組分組成：

該MRS固體培養基的pH值保持在6.2～6.4。

6.根據權利要求1所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的紅蕓豆乳的制備方法，其特征在于，步驟3)中，在共發酵之前，將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-206和干酪乳桿菌LcS-Met^-分別進行活化培養，納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-206在豆芽汁紅蕓豆汁液體培養基中進行活化培養，培養溫度為34～36℃，干酪乳桿菌LcS-Met^-在MRS液體培養基中進行活化培養，培養溫度為36～38℃。

7.根據權利要求6所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的紅蕓豆乳的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述的豆芽汁紅蕓豆汁液體培養基以1L計，由以下量的組分組成：

紅蕓豆汁????100～150mL；

蔗糖????????4.0～6.0g；

豆芽汁??????余量；

所述的MRS液體培養基以1L計，由以下量的組分組成：

該MRS液體培養基的pH值保持在6.2～6.4。