[發明專利]一種具有免疫調節活性的磷酸化K5多糖的制備方法

有效

• 申請號: 201410752309.6
• 申請日: 2014-12-10
• 公開（公告）號: CN104448021A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 滕麗萍;付海田;王敏;陳敬華
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00;A61K31/715;A61P37/02
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技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種具有免疫調節活性的磷酸化K5多糖的制備方法。

背景技術

大量的研究表明多糖類化合物作為一種免疫調節劑，它能激活免疫細胞，提高機體的免疫功能，而對正常細胞沒有毒副作用，而且炎癥、老化、腫瘤細胞的增殖及轉移、病原體感染等病理過程中都涉及糖鏈的參與，其抗腫瘤、抗病毒、抗凝血和免疫調節等生物活性已逐漸被臨床應用。多糖類化合物不僅本身具有多種生物活性,其衍生物也具有獨特的作用。如磷酸酯化、羧甲基化和羥乙基化以及硫酸化、乙酰化、磺酰化等，都可大大提高多糖或寡糖的生物活性。Nakashima等發現卡拉膠和肝素等具有抑制皰疹病毒復制的作用，但其脫硫酸化產物則不具有上述活性；Yoshida等發現香菇多糖經硫酸酯化后具有顯著的抗艾滋病毒作用。

作為肝素前體的大腸桿菌K5莢膜多糖(K5PS)為(-GlcUA-1,4-GlcNAc-1,4-)n的二糖重復單位(GlcUA代表葡萄糖醛酸；GlcNAc代表乙酰氨基葡萄糖)，是動物體內肝素和硫酸乙酰肝素的生物合成前體。K5PS可以作為一種非動物來源性的前體化合物，經過硫酸化、異構化等修飾合成肝素和硫酸乙酰肝素，或兩者的類似物。K5多糖的硫酸化衍生物具有與肝素類似的生物學活性，在抗凝血、抗病毒、抗炎等方面發揮一定的作用。在糖的衍生物中，磷酸酯是一類比較重要的糖類衍生物，研究表明磷酸酯類衍生物具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌和免疫調節劑等生物活性，在糖基上引入磷酸根能使一些本無活性的糖類化合物具有活性，而K5多糖磷酸酯類衍生物的制備及生物學活性研究尚未見報導。

發明內容

本發明的目的是提供一種具有免疫調節活性的磷酸化K5多糖的制備方法。

本發明的技術方案為：以磷酸(H₃PO₄)、五氧化二磷(P₂O₅)、磷酸三乙酯(Et₃PO₄)組合為磷酸化試劑，在甲基磺酸(CH₃SO₃H)的作用下，在室溫條件下完成K5多糖的磷酸化。

本發明提出的具有免疫調節活性的磷酸化K5多糖的制備方法的具體操作步驟如下：將一定量的脫乙酰化K5多糖溶于CH₃SO₃H中，磷酸化組合試劑H₃PO₄、P₂O₅和Et₃PO₄按一定比例混合加入反應體系中，氮氣保護狀態下，室溫反應3小時后，沉淀、透析得到磷酸化K5多糖。將制得的磷酸化衍生物作用于小鼠巨噬細胞系(Raw264.7細胞)，觀察其免疫調節活性。

本發明的獨到之處有兩點：首先將H₃PO₄、P₂O₅和Et₃PO₄按比例混合為磷酸化組合試劑，最大化的發揮磷酸化試劑的效用，從而得到磷酸化程度較高的衍生物；其次本發明對K5多糖進行磷酸化修飾，表現出新的生物活性，可作為潛在的免疫調節增強劑進行開發應用。

具體實施方式

以下利用實施例進一步詳細說明本發明，但不能認為是限定發明的范圍。

實施例一：K5多糖的制備

將由本實驗室保存的大腸桿菌K5菌株的甘油凍存液100μL接種于10mL?LB培養基中，轉速為200rpm，37℃恒溫培養活化過夜。用火焰滅菌的接種環取菌液在LB平板上劃線分離單菌落，接種于LB培養基中，轉速為200rpm，37℃恒溫培養至對數期。將得到的大腸桿菌K5菌株種子液以5％的接種量接種于10L?LB培養基(含有0.5％葡萄糖，0.5‰大豆油)中，轉速為600rpm，溶氧量30％，流加酸堿(2mol/L?KOH，30％H₃PO₄)維持pH于7.4左右，37℃培養16-18h后停止發酵。將醇沉沉淀、透析得到的粗多糖脫蛋白后，經DEAE瓊脂糖凝膠柱、G75葡聚糖凝膠柱純化后得到精制K5多糖。

實施例二：脫乙酰化K5多糖的制備

將K5多糖溶解于2mol/L?NaOH中，于60℃脫乙酰反應18h，反應結束后冷卻至室溫，用2mol/L?HCl調節pH至9.0，防止脫乙酰化后K5多糖由于氫鍵作用而沉淀，3500Da截留透析袋透析，收集透析液凍干，即得脫乙酰化的K5多糖。

實施例三：磷酸化K5多糖的制備