[發(fā)明專利]斑馬魚卵黃原蛋白間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒及其檢測(cè)方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410752194.0
• 申請(qǐng)日: 2014-12-09
• 公開（公告）號(hào): CN104569423A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汝少國(guó);王軍;王蔚;田華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 青島海昊知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 張中南;邱岳

1.一種檢測(cè)斑馬魚卵黃原蛋白的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒，包括一個(gè)盒體，盒體內(nèi)有空白96孔酶標(biāo)板1塊，封閉液、包被液、洗滌液、樣品稀釋液、顯色液、終止液和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗各1支，

其特征在于該盒體還裝有：斑馬魚卵黃脂磷蛋白純品1支，兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體1支。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)斑馬魚卵黃原蛋白的夾心ELISA試劑盒，其特征在于所述的斑馬魚卵黃脂磷蛋白制備方法如下：將斑馬魚卵巢取出后稱重，加入3倍體積4℃預(yù)冷的PBS緩沖液(內(nèi)含1mM?PMSF，pH?7.4)混合，在冰浴條件下用玻璃勻漿器勻漿，8000g離心10分鐘，收集上清液；將上清液進(jìn)行離子交換層析(DEAE-Sepharose?Fast?Flow)，用分別含0.07M、0.1M、0.2M和1.0M?NaCl的25mM?Tris-HCl緩沖液(pH?7.5)進(jìn)行不連續(xù)洗脫。收集0.2M洗脫組分，裝入截留分子量為100kDa的Millipore超濾離心管，4℃、3000g離心30分鐘，加入1ml?PBS緩沖液，收集截留在超濾離心管膜上的溶液；取1ml收集液加入Sephadex?G-200層析柱，用25mM?Tris-HCl緩沖液(pH?7.4)洗脫，收集第一個(gè)主洗脫峰，即為斑馬魚卵黃脂磷蛋白。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)斑馬魚卵黃原蛋白的夾心ELISA試劑盒，其特征在于所述的兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體的制備方法如下：

(1)斑馬魚卵黃原蛋白純品的制備：采用水體暴露17β-雌二醇的方式誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生卵黃原蛋白，將斑馬魚置于2L的玻璃缸中，每缸放入10尾斑馬魚，17β-雌二醇的暴露濃度為200μg/L，每天全部換水，并重新加入相應(yīng)的17β-雌二醇，早晚投喂飼料，水溫26℃；7天后將斑馬魚放入50％的酒精中，待斑馬魚麻醉后，取出稱重，并加入3倍體積4℃預(yù)冷的PBS緩沖液(內(nèi)含1mM?PMSF，pH?7.5)，在冰浴條件下用玻璃勻漿器勻漿，4℃、8000g離心10分鐘，收集上清液；利用權(quán)利要求2的方法從上清液中純化獲得斑馬魚卵黃原蛋白；

(2)兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體的制備：取600μg純化的斑馬魚卵黃原蛋白，加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化后對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)注射0.1ml，兩周后再次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為600μg/只，用弗氏不完全佐劑充分乳化后進(jìn)行背部皮下注射，此后，每隔10天按以上方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫；第5次注射后于第5天從心臟取血，6000r/min離心20分鐘，收集上清，獲得了兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗血清；抗體的純化分為以下幾步，上樣前向多克隆抗血清中加入1/3的對(duì)照陰性樣品(雄魚勻漿液)，低溫振蕩2h，4℃過(guò)夜，次日離心取上清；向上清中加入等體積的PBS緩沖液；在冰浴條件下加入等體積飽和硫酸銨，0℃震蕩2h后，低溫離心(8000rpm,15min)，棄上清，沉淀用10ml?PBS緩沖液溶解；用0.45微米孔徑的濾膜過(guò)濾后，上Hitrap?Protein?G柱，以PBS緩沖液洗脫10個(gè)柱體積后，用0.1M甘氨酸(pH?2.7)洗脫，即獲得兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體。

4.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)斑馬魚卵黃原蛋白的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒在環(huán)境雌激素類物質(zhì)篩選與內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)研究中的應(yīng)用。

5.利用權(quán)利要求1所述的試劑盒進(jìn)行內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)的方法，其特征在于包括以下步驟：

1)用包被液稀釋試劑盒中的斑馬魚卵黃脂磷蛋白純品至400ng/L，在空白96孔酶標(biāo)板中加入100μl/孔，4℃包被過(guò)夜。棄去孔內(nèi)溶液，洗滌3次。

2)在96孔酶標(biāo)板中加入封閉液，300μL/孔，室溫下孵育1小時(shí)。棄去孔內(nèi)溶液，洗滌3次。

3)在96孔酶標(biāo)板中加入用樣品稀釋液稀釋了的斑馬魚卵黃脂磷蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品50μL/孔，并在每孔加入50μL用樣品稀釋液1:5000倍稀釋的兔抗斑馬魚卵黃原蛋白抗體，37℃下孵育2小時(shí)。棄去孔內(nèi)溶液，洗滌5次。

4)在96孔酶標(biāo)板中加入用樣品稀釋液1:2000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗，100μL/孔，室溫孵育1小時(shí)。棄去孔內(nèi)溶液，洗滌5次。

5)在96孔酶標(biāo)板中加入新鮮配制的顯色液，100μL/孔，于室溫暗處37℃反應(yīng)10min。

6)待呈現(xiàn)明顯的黃色后加終止劑，50μL/孔。

7)用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)下各孔的吸光值，測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

8)計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，吸光率為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸光率公式為：B_i/B₀(％)＝(OD-NSB)/(OD₀-NSB)×100。B_i為標(biāo)準(zhǔn)品或樣品OD值，B₀為標(biāo)準(zhǔn)品0的OD值，NSB為非特異性結(jié)合的OD值。本實(shí)驗(yàn)中NSB為測(cè)定PBS包被的OD值。根據(jù)樣品的OD值計(jì)算其吸光率，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。