[發(fā)明專利]一種抗單核細(xì)胞增生李斯特菌的枯草芽孢桿菌C3細(xì)菌素的發(fā)酵方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410751937.2
• 申請日: 2014-12-11
• 公開（公告）號: CN104450577A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 熊利霞;劉慧;謝遠(yuǎn)紅;張紅星;金君華;高秀芝;董牧群;何珊
• 申請（專利權(quán)）人: 北京農(nóng)學(xué)院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P21/00;C12R1/125
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域中一種抗單核細(xì)胞增生李斯特菌的枯草芽孢桿菌C3細(xì)菌素的發(fā)酵方法，適用于食品防腐劑、飼用生物添加劑領(lǐng)域。

背景技術(shù)

細(xì)菌素是指某些細(xì)菌在代謝過程中通過核糖體合成的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽，是天然免疫防御系統(tǒng)的一部分。這類蛋白通常具有耐酸性好，抗菌譜廣、水溶性好、安全性高以及作用快速等特點。與抗生素相比，細(xì)菌素具有不殺滅益生菌、提高機體免疫機能、無副作用、無殘留、無耐藥性、可長期使用等優(yōu)點。植物乳桿菌素Nisin是迄今研究最廣泛的細(xì)菌素，但因堿性和熱穩(wěn)定性差、抗菌譜窄等缺陷，限制了其在食品中的應(yīng)用。

枯草芽孢桿菌及其細(xì)菌素可以用作食品防腐劑、飼料添加劑、農(nóng)用生物防治劑和動物防病劑，具有無毒、無殘留、不產(chǎn)生耐藥性、安全性高的優(yōu)點。

目前有關(guān)枯草芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵方法的專利報道僅有幾篇，專利CN102952835A發(fā)明了“一種枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)天蠶素抗菌肽的方法”，其要點是將天蠶素抗菌肽基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌在合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，表達(dá)天蠶素抗菌肽基因并分泌天蠶素抗菌肽到菌體外，發(fā)酵液天蠶素抗菌肽。專利CN102071162A發(fā)明了“枯草芽孢桿菌LFB112、其產(chǎn)生的細(xì)菌素及應(yīng)用”，其要點是研究了細(xì)菌素的理化特性，并未對其發(fā)酵條件進行研究。專利CN103333819B發(fā)明了“一株產(chǎn)生廣譜高效抗菌肽的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用”，其要點是可以用作食品防腐劑、飼料添加劑，僅對改抗菌肽進行了初步研究，并未對發(fā)酵條件進行深入研究。目前國內(nèi)發(fā)明專利及文獻中關(guān)于抗單增李斯特菌的枯草芽孢桿菌細(xì)菌素的發(fā)酵方法尚未見相關(guān)報道。

單核細(xì)胞增生李斯特菌在環(huán)境中無處不在，在絕大多數(shù)食品中都能找到李斯特菌。經(jīng)證實，肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都是李斯特菌的感染源。一旦感染李斯特菌，輕則出現(xiàn)發(fā)燒、肌肉疼痛、惡心、腹瀉等癥狀，重則出現(xiàn)頭痛、頸部僵硬、身體失衡和痙攣等癥狀。受感染的孕婦可能出現(xiàn)早產(chǎn)、流產(chǎn)和死產(chǎn)，嬰兒健康也可能受影響。

本發(fā)明篩選出一株對單增李斯特菌有明顯抑制效果的枯草芽孢桿菌C3，該菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素對熱和pH有良好的穩(wěn)定性，并可被蛋白酶K降解，用作食品防腐保鮮劑具有較高安全性和穩(wěn)定性，具備較好的開發(fā)應(yīng)用前景，而對于其發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)，目前仍面臨成本過高，生產(chǎn)過程復(fù)雜，產(chǎn)物效價低等問題，本發(fā)明提供了以上問題解決方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種以枯草芽孢桿菌C3為生產(chǎn)菌株發(fā)酵產(chǎn)抗單增李斯特菌細(xì)菌素的方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

所述方法中，所提供的枯草芽孢桿菌是：枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)C3，已于2013年7月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)，保藏號為：CGMCC?No.7913。

枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)C3，分離篩選自北京農(nóng)學(xué)院果園土壤。

在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)C3的菌落大小為3～5mm，灰白色、不透明、表面干燥、邊緣不整齊，菌體細(xì)胞呈長桿狀，短鏈狀排列，中生芽孢，G⁺好氧菌。

枯草芽孢桿菌C3發(fā)酵上清液細(xì)菌素的粗提物對單增李斯特菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、白邊青霉生長有抑制作用，其中對單增李斯特菌的抑菌活性最強，抑菌圈直徑為23.08mm。

將甘油冷凍管保種的枯草芽孢桿菌C3菌株接種于5mL的C3菌株種子培養(yǎng)基中，于37℃，160r/min搖床培養(yǎng)16～20h，如此活化2～3代，得到種子液；將活化好的種子液以2％的接種量接種至盛有50mL種子培養(yǎng)基250mL的三角瓶中，于37℃，160r/min搖床培養(yǎng)12h，得到擴大培養(yǎng)液。

枯草芽孢桿菌C3種子培養(yǎng)基配方為(質(zhì)量體積濃度，W/V)：1％葡萄糖，1％蛋白胨，1％NaCl，0.15％KH₂PO₄，0.15％MgSO₄·7H₂O，1000mL蒸餾水，pH自然。

所述方法中，在上述試驗的基礎(chǔ)上，通過單因素多水平試驗優(yōu)化產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基配方：1％乳糖、4％酵母浸粉、0.1％磷酸二氫鉀、0.15％七水合硫酸鎂、0.5％氯化鈉、pH為7～7.5。