[發明專利]一種檢測溶菌酶的試劑盒

在審

• 申請號: 201410750845.2
• 申請日: 2014-12-10
• 公開（公告）號: CN104531845A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 時鵬飛;任銳;郗冬梅;周宏;張書圣
• 申請（專利權）人: 臨沂大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/34
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明涉及脫氧核糖核酸（以下簡稱“DNA”）循環放大技術，具體地說是基于DNA循環放大技術對溶菌酶進行免疫分析檢測的試劑盒及測試方法。

背景技術

溶菌酶又稱為N-乙酰胞壁質聚糖水解酶或胞壁質酶，是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。主要通過水解革蘭氏陽性菌的細胞壁中的胞壁脂多糖而破壞細胞壁，導致細胞壁破裂內容物逸出而使細菌溶解。并且，溶菌酶可以與帶負電荷的病毒蛋白直接結合，與DNA脫輔基蛋白形成復鹽，使病毒失活。因此，溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。該酶廣泛存在于鳥類和家禽的蛋清、哺乳動物的唾液、淚液、氣管等分泌物中。溶菌酶是多種動物組織的內源性免疫系統的重要組成部分，而且在不同組織處其正常含量也各不相同。很多組織中的溶菌酶含量的變化通常會與某些疾病相關聯。例如，血液的尿液中溶菌酶濃度異常意味著血液或腎臟方面的疾病；新生兒體內溶菌酶缺乏可能會導致支氣管性肺發育障礙；食譜中溶菌酶缺乏可能會增加患痢疾病的發生。因此，對體內溶菌酶的檢測在對很多疾病診斷中起著非常重要的作用。

DNA循環放大技術是很多免疫檢測中經常用到的方法之一，通常包括等溫擴增、滾環復制、雜交鏈式反應。由于自身信號放大，DNA循環放大技術具有消耗樣品量少、快速、靈敏的優勢，近年來被廣泛應用于DNA、細胞、生物分子和胚胎的檢測。將多個反應設計成可以自發循環的過程，從而能夠將信號多次放大，這將會有效提高對目標物的檢測限同時減少對樣品的消耗量。基于此，選擇設計合適的信號探針、引物、聚合酶是關鍵。自從1992年Fleming發現溶菌酶以來，對體內溶菌酶的檢測一直在不斷的開展，并取得了一定的進展。然而，操作簡單、具有高特異性、高靈敏性的溶菌酶檢測方法仍然是研究者所關注并不斷追求的。

本發明的試劑盒設計成以溶菌酶的適體識別引發，通過DNA雜交、DNA鏈（靶）替換、聚合反應循環實現對信號的放大，進而實現對溶菌酶高靈敏和高特異選擇性的檢測。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測溶菌酶的試劑盒，該試劑盒操作程序簡單、靈敏度高、特異選擇性好，適用于尿液、人體血清中溶菌酶的快速檢測。

本發明中試劑盒的組成為：兩條信號探針、一條引物、聚合酶Klenow、緩沖液NEBuffer。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

1、??合成探針1：設計三條寡聚脫氧核糖核苷酸序列（S1，S2，S3），S1為含有溶菌酶適體序列并修飾四甲基羅丹明熒光基團；S2為一端修飾氨基，便于與磁珠結合，并且其序列部分可以與S1和S3互補；S3則為與S2部分互補的序列。三條寡聚核糖核苷酸序列通過雜交結合在一起，并通過S2上的氨基與羧基修飾的磁珠結合從而形成了信號探針1。

2、??合成探針2：設計兩條寡聚脫氧核糖核苷酸序列（S4、S5），S4為一端修飾氨基的發卡結構，便于與磁珠結合；S5為一端修飾四甲基羅丹明熒光基團并且其序列能夠與S4的莖序列互補。兩條寡聚核糖核苷酸序列通過雜交結合在一起，并通過S4上的氨基與羧基修飾的磁珠結合從而形成了信號探針2。

3、??溶菌酶檢測：把溶菌酶，引物（S6）加入到上述合成的探針中，首先溶菌酶通過與其適體互補雜交引發；探針1中S1與S2雜交作用被破壞，部分序列片段被暴露出來；通過引物，在聚合酶和dNTP作用下引發DNA聚合反應，反應延伸的新鏈將溶菌酶與S1的復合體以及S3替換下來，釋放到溶液中；在聚合酶和dNTP作用下引發第二個聚合反應，此時溶菌酶被釋放下來，可以進入下一個反應形成一個循環。替換下來的S3遇到信號探針2，通過雜交結合在一起；在引物、聚合酶和dNTP作用下引發聚合反應，S3再次被釋放到溶液中，進入下一個反應形成另一個循環。

4、??熒光強度測試：取上述反應后的上清液稀釋后進行熒光測試。

本發明的主要創新性和優越性為：

1、??本發明采用“一鍋煮”的方法，實驗操作簡單。

2、??本發明以溶菌酶適體識別引發，可以高特異選擇性的檢測溶菌酶。

3、??通過兩個DNA循環放大熒光信號，可以高靈敏的檢測溶菌酶。

附圖說明

圖1為本發明用于熒光檢測溶菌酶的示意圖。

圖2?A為熒光響應曲線；B為工作曲線。

具體實施方式