[發明專利]誘導DC成熟并分泌高濃度促炎因子的方法

在審

• 申請號: 201410750830.6
• 申請日: 2014-12-09
• 公開（公告）號: CN104593325A
• 公開（公告）日: 2015-05-06
• 發明（設計）人: 陶然;韓研妍;李進;周向軍
• 申請（專利權）人: 深圳源正細胞醫療技術有限公司;深圳市源興生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784;A61K39/00;A61K35/15;A61P35/00
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

技術領域

本發明屬于免疫細胞體外培養領域，涉及誘導DC成熟并分泌高濃度促炎因子的方法。

背景技術

DC是目前發現的功能最強大的抗原提呈細胞(antigen?presenting?cell,APC)。近年來，以樹突狀細胞(dendritic?cell,DC)為基礎的腫瘤免疫治療及DC疫苗已取得較大進展，體外制備的DC疫苗顯示出明顯誘發抗腫瘤免疫應答的能力，具有良好的臨床應用前景。目前，從外周血單個核細胞(PBMC)經GM-CSF、IL-4體外誘導培養DC的方法已基本得到公認，但DC體外促成熟的方案尚沒有統一的標準，國內主要采用TNF-a因子，但該方法活化的DC成熟度低下，不能分泌促炎因子IL-12，致使培養得到的DC功能缺陷，很大程度上限制了DC疫苗的臨床應用工作的開展。因此，有必要對現有DC細胞培養方案進行進一步完善，以有效提高DC疫苗在誘導抗炎或抗腫瘤免疫應答中的作用。

DC在腫瘤、感染、器官移植等領域已顯示出其免疫治療的安全性及有效性，但體內DC數量極少，故目前臨床所用DC多是采集DC前體細胞經體外培養得到。DC前體細胞經不同細胞因子作用，誘導出未成熟DC(immature?DC,iDC)攝取和加工抗原；然后再經不同的促成熟因子作用，生成成熟DC(mature?DC,mDC)，其成熟狀態決定機體免疫調節的方向。只有成熟DC才能有效呈遞抗原，表達各種表面分子和共刺激分子，分泌多種細胞因子，提供三種信號活化T淋巴細胞，激活特異性細胞免疫反應，誘導Th1型免疫反應。在抗腫瘤免疫反應中，Th1免疫反應被認為在抗腫瘤免疫中發揮重要作用；而Th2以及Treg反應則被認為引起免疫耐受。在這個過程中，DC細胞分泌的促炎因子IL-12水平起了關鍵性的作用。高水平的IL-12被證實可有效極化Th1細胞的產生，從而輔助誘導抗原特異性的CD8+CTL細胞生成。此外，IL-12還可直接作用CD8+T細胞使其增殖，增強細胞免疫效應以及形成長久記憶性T淋巴細胞。因此，能夠分泌高水平的IL-12是DC細胞生物活性高的標志之一。

現有的DC培養技術未能足夠重視DC促成熟過程，同時考慮成本因素，往往僅用干擾素a作為促成熟因子。實驗研究表明干擾素a促成熟DC細胞成熟度不足，表面標記表達低，促炎因子分泌低，活化免疫功能差。因此有必要對現有DC細胞培養方案進行進一步完善，以有效提高DC疫苗在誘導抗炎或抗腫瘤免疫應答中的作用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種誘導DC成熟并分泌高濃度促炎因子的方法。

為實現上述目的，根據本發明的一個方面，本發明提供了一種誘導DC成熟并分泌高濃度促炎因子的方法。根據本發明的實施例，該方法的步驟為：將前體單核細胞用新鮮的無血清樹突狀細胞培養液懸浮，使細胞密度為2x10⁵-1x10⁶/ml，在37℃，5％CO₂培養箱中培養5-6天，然后加入IL-1β與TLR刺激，并于37℃，5％CO₂培養箱培養24-48小時后收獲成熟的樹突狀細胞。

根據本發明的實施例，所述IL-1β的用量是500-10000U/ml，TLR的用量是1-50ng/ml。

根據本發明的實施例，所述IL-1β的用量為1000U/ml，TLR的用量為5ng/ml。

根據本發明的實施例，所述前體單核細胞是外周血單個核細胞。

根據本發明的實施例，所述的無血清樹突狀細胞培養液是含有500U/ml的GM-CSF和400U/ml的IL-4的無血清培養液。

根據本發明的實施例，所述的無血清培養液是Life?Technology公司的AIM-V，或者Lonza公司的X-VIVO。

根據本發明的另一方面，本發明還提供了所述方法制備得到的成熟DC細胞用于制備臨床細胞治療和腫瘤免疫治療藥物或疫苗的用途。

根據本發明的又一方面，本發明提供了一種組合物，由IL-1β與TLR組成，在樹突狀細胞培養液中，IL-1β的用量是500-10000U/ml，TLR的用量是1-50ng/ml。

根據本發明的實施例，所述IL-1β的用量是1000U/ml；TLR的用量是5ng/ml。