[發明專利]一種有機污染物致大鼠肝臟細胞凋亡的方法

在審

• 申請號: 201410750636.8
• 申請日: 2015-08-04
• 公開（公告）號: CN104498581A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發明（設計）人: 敖云霞
• 申請（專利權）人: 敖云霞
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 程新敏

技術領域

一種有機污染物致大鼠肝臟細胞凋亡的方法，屬于衛生檢測技術領域。

背景技術

關于有機污染物致肝臟損傷的機制尚無統一定論，涉及的學說眾多：如苯并芘和滴滴涕可引起肝細胞凋亡、多氯聯苯可致肝微粒體CYP1A1酶活力異常改變、二氯溴烷能夠誘導肝細胞腺瘤形成等。其中，細胞凋亡作為一種由基因控制的程序性細胞死亡,在保持器官和組織的穩定性方面起著重要作用,不正常的凋亡調控可以引起組織器官損傷乃至癌癥等疾患。近年來多項研究表明肝細胞凋亡在肝病的發生、發展中發揮著重要作用，參與許多肝臟疾病的病理過程。凋亡過度或不足都會導致不同程度的肝損傷，如爆發性肝衰竭、肝硬化、病毒性肝炎、自身免疫性肝病以及肝臟腫瘤等。近年的研究也多認為各種原因引起的肝細胞損傷與細胞凋亡有著密切的關系。檢測細胞凋亡的方法很多，有形態學觀察法、標記法、流式細胞儀技術、ELISA法，本實驗使用的方法不但能從形態上觀察凋亡細胞和凋亡小體，同時也能了解其分布并進行定量分析，是標記凋亡細胞較可靠的方法。

發明內容

本發明的目的是：提供一種有機污染物致大鼠肝臟細胞凋亡的方法，能直觀的發現肝臟的損害情況。

本發明的技術方案

一種有機污染物致大鼠肝臟細胞凋亡的方法，該方法利用固相萃取法提取有機污染物，對大鼠進行經口亞慢性灌胃染毒，染毒90天后固定、包埋、脫蠟、洗滌、消化、閉液、洗滌、顯色觀察肝臟細胞發生的變化，以達到直觀、清楚地觀察肝細胞凋亡的部位及數量。

????前述的一種有機污染物致大鼠肝臟細胞凋亡的方法中，采用固相萃取法富集水中有機污染物，萃取劑為XAD-2樹脂，洗脫劑為二氯甲烷和甲醇，水樣過柱流速為4倍柱體積/min，過柱完后依次用3倍柱體積的二氧甲烷和甲醇先后洗柱，流速0.1倍柱體積/min，洗脫液經旋轉蒸發儀25℃減壓蒸餾揮干，將已揮干的濃縮提取物用玉米油定容至50L/ml（母液）-20OC冰箱保存備用。

????前述的一種有機污染物致大鼠肝臟細胞凋亡的方法中，將40只SD大鼠按隨機區組法分為4組，每組10只，雌雄各半，1組為對照組(予玉米油)，其余3組為低、中、高劑量染毒組，依據預實驗結果，確定大鼠染毒高劑量組劑量為80L飲用水有機污染物提取物/kg.bw.day，向下設置低、中2個劑量組，分別為20L/kg.bw.day，5L/kg.bw.day。

????由于采用了上述技術方案，與現有技術相比，由于隨染毒劑量升高，大鼠肝細胞凋亡指數逐漸升高，尤以中、高劑量組明顯。進一步進行相關性分析發現肝細胞的凋亡存在劑量依賴性。提示該地飲用水有機污染物較高劑量亞慢性暴露可誘導大鼠肝細胞發生細胞凋亡。本實驗使用的方法不但能從形態上觀察凋亡細胞和凋亡小體，同時也能了解其分布并進行定量分析，被認為是標記凋亡細胞較可靠的方法。

具體實施方式

下面對本發明進一步的詳細說明，但不作為對本發明的任何限制。

1?材料與試劑

1材料

1.1?主要試劑及其配制

1.1.1?主要的試劑

脫脂奶粉(武漢博士德公司)；甲醇(上海生工)；過硫酸銨(APS)、Tween?20、Tris、甘氨酸、SDS、二甲苯：上海碧云天公司。

1.1.2?試劑的配制10×TBS

Tris、24.2gNacl?、80g加700ml蒸餾水溶解后用1MolHcl調PH至7.6，再加蒸餾水定容至1L

2.2?主要的儀器

高速臺式冷凍離心機(Sigma?2-16k，美國Sigma公司)、顯微鏡(BX51，日本奧林巴斯公司)、透射電子顯微鏡(日立H-7650，日本日立公司)、抽真空型脫水機(Leica?TP1020，德國徠卡公司)、生物組織石蠟包埋機(YB-6LF，孝感市亞光醫用電子科技公司)、旋轉式超薄切片機(LEICA?RM2135，德國徠卡公司)、徠卡攤片機(HI1210，德國徠卡公司)、徠卡烘片機(HI1220，德國徠卡公司)。

2??實驗方法

(1)?載玻片預先用多聚賴氨酸浸泡處理,大鼠肝臟組織用10%多聚甲醛固定,石蠟包埋制作切片。

(2)?肝臟切片常規脫蠟入水：將切片依次浸入二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min、95%乙醇Ⅰ4min、95%乙醇Ⅱ3min、80%乙醇2min、蒸餾水洗1min。

(3)?新鮮配制3%乙酸(pH=2.5)室溫處理10min,蒸餾水洗滌2min×3次。