[發(fā)明專利]一種提純雞卵黃免疫球蛋白ＩｇＹ方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410750608.6
• 申請日: 2014-12-10
• 公開（公告）號: CN104497139A
• 公開（公告）日: 2015-04-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 敖云霞
• 申請（專利權(quán)）人: 敖云霞
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K16/02;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/34
• 代理公司: 貴陽中新專利商標(biāo)事務(wù)所 52100
• 代理人: 程新敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種提純雞卵黃免疫球蛋白ＩｇＹ方法，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

近年來，將含有特異性ＩｇＹ的免疫雞蛋口服用于防治輪狀病毒腹瀉、脊髓灰質(zhì)炎、甲型肝炎和其它腸道感染性疾病并取得滿意效果，亦有口服特異性ＩｇＹ雞蛋產(chǎn)品替代抗生素成功治療胃腸道疾病的報道，雞卵黃抗體（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｏｆｅｇｇｙｏｌｋ，ＩｇＹ）是由母雞血液中ＩｇＧ轉(zhuǎn)移至其卵黃中對子代產(chǎn)生保護性作用的免疫球蛋白，免疫雞蛋黃中含有大量來源于血清的ＩｇＧ抗體（即ＩｇＹ），濃度遠高于血清，維持時間長達２８周，具有高度穩(wěn)定性和生物學(xué)活性，這使雞卵黃抗體ＩｇＹ口服防病治病成為可能，目前國內(nèi)外已有較多關(guān)于怎樣從雞蛋黃中提?。桑纾俚膱蟮?，但存在諸如實驗步驟繁瑣不易操作、ＩｇＹ提取的純度與得率均較低等缺點。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是：提供一種提純雞卵黃免疫球蛋白ＩｇＹ方法，該方法能準(zhǔn)確分析株革蘭陰性桿菌的分布和耐藥性制備ｌｇＹ具有純度高、得率高、特異性強及利用小體積樣品獲得大量純化蛋白的優(yōu)點，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明的技術(shù)方案

一種提純雞卵黃免疫球蛋白ＩｇＹ方法，該方法采用pＨ５.１水稀釋法加鹽析法,即兩步硫酸銨法對提純雞卵黃除脂，以獲得較高純度的ＩｇＹ。

前述的一種提純雞卵黃免疫球蛋白ＩｇＹ方法中，所述兩步硫酸法為將蛋黃液加入雙蒸餾水后使得pH值為5.1，通過離心并用濾紙過濾除脂后得到上清液，上清液加入硫酸銨晶體，采用離心方法獲得白色沉淀，將白色沉淀放入pH7.4PBS中，再加入硫酸銨晶體，再次加入硫酸銨晶體，然后離心獲得白色沉淀并融入pH7.4的PBS中，置于雙蒸水中攪拌透析得到樣品。

由于采用了上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的兩步硫酸銨法提純的ＩｇＹ純度與得率均高于飽和硫酸銨法，用ＢａｎｄＳｃａｎ軟件分析蛋白純度，前者所得的ＩｇＹ純度可達９０％以上，而后者所得的ＩｇＹ純度約為７２％,用Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法測定ＩｇＹ蛋白濃度，前者蛋白得率為６.２５ｇ／Ｌ蛋黃，后者蛋白得率僅為４.２５ｇ／Ｌ蛋黃。顯然兩步硫酸銨法提取的ＩｇＹ純度與得率均高于后者。

具體實施方式

下面對本發(fā)明進一步的詳細(xì)說明，但不作為對本發(fā)明的任何限制。

本發(fā)明的實施例：

１　材料與方法

１．１　動物與試劑

羅曼母雞由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ凝膠配制試劑盒Ｐ００１２Ａ、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Ｐ００６１、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ蛋白上樣緩沖液（５Ｘ）、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ電泳液Ｐ００１４Ｂ、考馬斯亮藍染色液（常規(guī)法）Ｐ００１７Ｂ、考馬斯亮藍脫色液（常規(guī)法）Ｐ００１７Ｃ、ＰＢＳ、硫酸銨、ＥＤＴＡ均由碧云天生物技術(shù)研究所提供。

１.２???ＩｇＹ提取與純化

１.２.１　兩步硫酸銨提取方法

取消毒完畢的雞蛋１個，用剪刀打開一個小洞，讓蛋清緩緩流出至不能再流出后，再以無菌生理鹽水洗凈卵清，將整個卵黃小心移至濾紙上，來回滾動，除盡蛋清,再用針頭刺破蛋黃，使之移到量筒。量取約８ｍｌ蛋黃液，加１０倍雙蒸水稀釋卵黃，混勻后調(diào)ｐＨ值為

５.１，－２０℃過夜，室溫解凍，１２０００ｒ／ｍｉｎ４℃離心３０ｍｉｎ，再將上清液用濾紙過濾除脂，獲得較清上清液,上清液加入硫酸銨晶體，使其濃度為１９％，靜置１ｈ后，再次以１２０００ｒ／ｍｉｎ４℃離心１５ｍｉｎ，取其白色沉淀,將白色沉淀溶于１５ｍｌ０.０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７-４ＰＢＳ中，再加入硫酸銨晶體，使其濃度為１４％，再次靜置１ｈ后，再次以１２０００ｒ／ｍｉｎ４℃離心１５ｍｉｎ，取其白色沉淀，溶于０-０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７.４的ＰＢＳ２ｍｌ中,置于雙蒸水中攪拌透析，１ｈ后更換透析液一次，共４～５次，透析過夜后，析出透析后的樣品，再以０.２２μｍ濾器過濾滅菌,獲得ＩｇＹ后用無菌ＥＰ管盛裝，置－２０℃保存。

１.２.２　透析袋處理

在３００ｍｌ透析處理液（２％ＮａＨＣＯ_３、１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，ｐＨ８.０）中將透析袋煮沸１０ｍｉｎ后，以蒸餾水徹底漂洗后再在３００ｍｌ（ｐＨ８）１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ液中煮沸１０ｍｉｎ，再以滅菌水里外徹底沖洗。

１.２.３　飽和硫酸銨提取方法