[發(fā)明專利]一種利用重組鈍齒棒桿菌生產(chǎn)黑色素的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410748908.0
• 申請日: 2014-12-09
• 公開（公告）號: CN104480137A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 饒志明;胡桂元;郭靜;楊套偉;徐美娟;張顯
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/77
• 分類號: C12N15/77;C12N15/66;C12N1/21;C12N9/02;C12P1/06;C12R1/15;C12R1/465
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技術(shù)領(lǐng)域

一株產(chǎn)酪氨酸酶的重組鈍齒棒桿菌的構(gòu)建及其在黑色素生成中的應(yīng)用，本發(fā)明屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。具體涉及一種酪氨酸酶基因工程菌的構(gòu)建及其應(yīng)用于黑色素的生物轉(zhuǎn)化。

技術(shù)背景

黑色素廣泛存在于動物、植物和微生物中。它在工業(yè)和農(nóng)業(yè)上廣泛應(yīng)用，可以作為防曬霜，天然染發(fā)劑成分，陽離子的螯合劑，非晶態(tài)半導(dǎo)體和生物農(nóng)藥的光保護(hù)劑。此外，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用于清除自由基，抗輻射，防止磷脂脂質(zhì)體的氧化，也用于治療黑色素缺乏的一些相關(guān)疾病。然而許多合成色素對人體有一定的危害，有的甚至?xí)掳?，因此天然黑色素的安全性越來越受到人們的關(guān)注。

目前，黑色素有從黑玉米，黑木耳，烏骨雞等動植物中提取，從動物或植物中提取的黑色素，雖然沒有對人體的危害，但由于繁瑣的生產(chǎn)成本較高，不能大規(guī)模生產(chǎn)。微生物資源非常豐富，利用微生物發(fā)酵產(chǎn)黑色素有巨大的優(yōu)勢，生產(chǎn)工藝簡單，操作方便，此外，由微生物產(chǎn)生的黑色素?zé)o毒，無害，穩(wěn)定性更好。酪氨酸酶是(E.C.1.14.18.1)是黑色素合成過程中的關(guān)鍵酶。酪氨酸酶是一種含銅酶，具有單酚和雙酚活性的酶，催化L-酪氨酸經(jīng)過左旋多巴(L-二羥基苯丙氨酸)合成多巴醌，然后經(jīng)過一系列的自然氧化，最后生成黑色素。目前國內(nèi)外研究表明某些細(xì)菌具有生產(chǎn)黑色素的能力，主要包括弧菌屬，根瘤菌，鏈霉菌和大腸桿菌工程菌株等。

本發(fā)明首次報道了來自于本實驗室篩選到的一株被命名Streptomyces?kathirae?SC-1的菌株的酪氨酸酶基因，通過質(zhì)粒pXMJ19，實現(xiàn)了在鈍齒棒狀桿菌SYPA?5-5中的表達(dá)，并且在本實驗室已經(jīng)研究了酶學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)上，以酪氨酸為底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生成黑色素，產(chǎn)量達(dá)到3.49g/l。鈍齒棒狀桿菌作為安全穩(wěn)定的工業(yè)生產(chǎn)菌株，發(fā)酵周期短，在醫(yī)藥等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供：一株產(chǎn)酪氨酸酶重組鈍齒棒桿菌的構(gòu)建及其黑色素的生物轉(zhuǎn)化。

本發(fā)明的主要研究內(nèi)容：本發(fā)明利用分子技術(shù)克隆了來自Streptomyces?kathirae?SC-1的酪氨酸酶基因(melC1C2)，構(gòu)建重組表達(dá)載體pXMJ19-melC1C2，并將其電擊轉(zhuǎn)化到C.crenatum?SYPA5-5，成功構(gòu)建了基因工程菌C.crenatum?SYPA5-5/pXMJ19-melC1C2。對構(gòu)建的基因工程菌進(jìn)行酶活測定，發(fā)現(xiàn)重組菌的酪氨酸酶活為61.5U/ml，而原始菌株C.crenatum?SYPA5-5沒有酶活。本發(fā)明首次將重組鈍齒棒桿菌應(yīng)用于黑色素的生產(chǎn)。

具體實施方式

實施例1：目的基因的擴(kuò)增及重組鈍齒棒桿菌的構(gòu)建

質(zhì)粒pXMJ19-melC1C2構(gòu)建具體過程如下：

首先，以菌株Streptomyces?kathirae?SC-1的染色體DNA為模板，利用引物P1和P2，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增得到一段1230bp大小的核苷酸序列如SEQ所示的melC1C2基因，先與pMD18-T?vector連接，獲得該基因的大量克隆，使用氨芐青霉素抗性平板篩選重組菌，重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI/KpnI酶切釋放出大小為2.7kb和1.2kb的基因條帶，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。質(zhì)粒pMD18-T-melC1C2和pXMJ19經(jīng)BamHI/KpnI雙酶切，膠回收純化，T4DNA連接酶過夜連接兩片段，過夜后將連接物熱擊轉(zhuǎn)化E.coli?JM109感受態(tài)細(xì)胞，使用氯霉素抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI/KpnI雙酶切后后釋放出大小為6.6kb和1.2kb的基因片段，表明該重組質(zhì)粒pXMJ19-melC1C2構(gòu)建成功。將經(jīng)驗證構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pXMJ19-melC1C2用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至鈍齒棒桿菌。挑取在具有氯霉素抗生素壓力平板上長出的菌落，搖瓶發(fā)酵，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證，結(jié)果表明重組鈍齒棒桿菌C.crenatum?SYPA5-5/pXMJ19-melC1C2構(gòu)建成功。對原始菌以及重組菌胞內(nèi)蛋白表達(dá)分析可以看出，基因melC1C2在重組菌中成功實現(xiàn)表達(dá)。

以Streptomyces?kathirae?SC-1的染色體DNA為模板，設(shè)計兩條引物，PCR擴(kuò)增引物設(shè)計如下：

P1：5’-ATTCGCGGATCCAAAGGAGG-3’(BamHI)

P2：5’-ACGTCTGAGGTACCCCGAATC-3’(KpnI)

實施例2：

重組菌株酶活測定