[發明專利]一種具有殺線蟲功能的刀孢輪枝霉基因工程菌株及其應用

在審

• 申請號: 201410748810.5
• 申請日: 2014-12-09
• 公開（公告）號: CN104593276A
• 公開（公告）日: 2015-05-06
• 發明（設計）人: 李娟;田艷梅;喬燕;張克勤
• 申請（專利權）人: 云南大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;A01N63/04;A01P5/00;C12R1/645
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

技術領域：

本發明涉及一種具有殺線蟲功能的刀孢輪枝霉基因工程菌株(Lecanicillium?psalliotae?AaIT)及其應用，屬生物農藥技術領域。

背景技術：

植物寄生線蟲是世界范圍內普遍發生的植物病害。據統計，全球每年因植物寄生線蟲造成的直接經濟損失高達1570億美元，其中尤以根結線蟲、胞囊線蟲最為嚴重。在我國，植物寄生線蟲危害蔬菜、糧食、煙草、油料、水果等幾乎所有的農作物，對許多重要農作物的危害已經超過其它植物病害，且呈逐年增加的趨勢。目前，我國對植物寄生線蟲的防治主要依賴于化學農藥。但化學農藥在毒殺線蟲的同時，對其他生物的高毒性，在農作物和土壤環境中的殘留等，都嚴重影響食品安全與環境生態安全。隨著經濟發展，我國社會正由溫飽型向全面小康型轉變，人民生活也由吃飽向吃好轉變，健康綠色食品是現代生活的基本需求。因此，研究開發生物殺線蟲劑已經成為現代農業可持續發展中必須解決的關鍵問題。而利用線蟲天敵對有害線蟲進行生物防治逐漸受到人們的關注。盡管食線蟲真菌作為重要的線蟲生防資源已經得到廣泛的研究和應用，但現有微生物殺線蟲劑毒力有限、防效不穩成為建立作物病原線蟲有效防控體系面臨的主要難題。因此，通過增強殺線蟲真菌的毒性，提高殺線蟲真菌和細菌的殺線蟲能力，構建高效線蟲生防工程菌，成為有效控制病原線蟲的新途徑。

蝎子毒是一種神經毒素，能作為研究蛋白質的理想材料；由于蝎子毒素具有高度選擇性和特異性，而且編碼的基因較小，便于分子操作，因此是研究蛋神經生物學、免疫學、白質工程和離子通道的理想材料。近年來，已經有不少學者利用蝎子毒來開發新型生物殺蟲劑。例如，Wang等曾將一種來自黃肥尾蝎(Androctonus?australis)的昆蟲特異性神經毒素(neurotoxin)AaIT轉入金龜子綠僵菌(Metarhizium?anisopliae)中，促進這種真菌殺蟲劑的毒性。Lu等人2008年將蝎子毒基因AaIT成功轉入昆蟲病原真菌球孢白僵菌Beauveria?bassiana中，同樣大大提高了該菌對昆蟲的毒殺作用。雖然將蝎子毒基因轉入昆蟲病原菌中提高昆蟲病原菌對昆蟲的毒性已經報道，而目前為止，尚無利用蝎子毒基因構建線蟲生物防治工程菌株的報道。

在眾多食線蟲真菌中，輪枝霉(Lecanicillium)是一類非常重要的生物防治真菌資源，它們能寄生于游離線蟲(內寄生)和固著線蟲的卵、雌蟲及胞囊。刀孢輪枝霉(Lecanicillium?psalliotae)作為輪枝霉屬中最為重要的食線蟲真菌，具有極強的殺線蟲效果。本發明以具有較好生防效果的刀孢輪枝霉作為出發菌株，運用原生質體轉化技術將自于黃肥尾蝎的蝎毒素基因AaIT導入，得到具有更高殺線蟲活性的工程菌株。

經文獻檢索，未見與本發明相同的公開文獻報道。

發明內容：

本發明的目的在于提供一種具有殺線蟲功能的刀孢輪枝霉基因工程菌株(Lecanicillium?psalliotae?AaIT)及其應用。

本發明通過對一株刀孢輪枝霉菌株進行基因改造，提高殺線蟲活性，開發高效生物殺線蟲制劑。本發明通過對刀孢輪枝霉菌株(中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)菌株號：CGMCC1312)進行基因工程改造，通過原生質體轉化技術將來自于黃肥尾蝎的蝎子毒基因AaIT轉入到刀孢輪枝霉菌株中，獲得一株具有較高殺線蟲活性的刀孢輪枝霉基因工程菌株(Lecanicillium?psalliotae-AaIT)。該工程菌株已于2014年12月5日保藏在中國典型培養物保藏中心；保藏單位地址：中國武漢市武漢大學；保藏號為CCTCC?M?2014629。

插入的AaIT的基因序列如下：