[發明專利]改善的細菌膜蛋白分泌

在審

• 申請號: 201410748438.8
• 申請日: 2010-11-15
• 公開（公告）號: CN104531734A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: C.C.黃;L.盧
• 申請（專利權）人: 詹森生物科技公司
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N15/31;C12N15/70;C12N7/01;C12N1/21;C40B40/02
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 梁謀

1.一種編碼用于引導蛋白質從細菌質膜轉運的細菌分泌信號的分離的多核苷酸，所述分泌信號選自pelB的P6S變體(SEQ?ID?NO:?1)和ompA的A11P變體(SEQ?ID?NO:?3)。

2.根據權利要求1所述的分離的多核苷酸，其與編碼外源蛋白的序列有效連接，其中所述外源蛋白待從所述細菌質膜分泌。

3.根據權利要求2所述的分離的多核苷酸，其中所述外源蛋白還與編碼選自pIII、pVII、pVIII和pIX的噬菌體外殼蛋白的序列有效連接，并且其中如此形成的融合蛋白待從細菌質膜分泌。

4.根據權利要求3所述的分離的多核苷酸，其中所述外源蛋白選自包含肽、抗體重鏈恒定結構域、抗體重鏈、哺乳動物受體鏈、受體胞外結構域、纖連蛋白樣結構域和錨蛋白重復結構域的多肽。

5.一種載體，所述載體包含與編碼源于外源蛋白質的氨基酸序列的多核苷酸有效連接的編碼細菌分泌信號的核酸序列，所述編碼的分泌信號選自pelB的P6S變體(SEQ?ID?NO:?1)和ompA的A11P變體(SEQ?ID?NO:?3)，其中與野生型分泌信號相比，所述分泌信號增強從細菌質膜轉運出來的外源蛋白的比例。

6.根據權利要求5所述的載體，其中所述編碼的外源蛋白質編碼序列還與編碼選自pIII、pVII、pVIII和pIX的絲狀噬菌體外殼蛋白的序列融合。

7.根據權利要求6所述的載體，所述載體為噬菌粒載體。

8.根據權利要求6所述的載體，所述載體為噬菌體載體。

9.根據權利要求8所述的載體，其中與突變型分泌信號連接的外源蛋白編碼序列與pVII融合并且與突變型分泌信號連接的外源蛋白序列與pIX融合，從而導致當所述載體在宿主細胞中復制時所述兩種外源蛋白以多拷貝出現在所述噬菌體顆粒的表面上。

10.根據權利要求6所述的載體，其中所述編碼的外源蛋白選自肽、抗體重鏈恒定結構域、抗體重鏈、哺乳動物受體鏈、受體胞外結構域、纖連蛋白樣結構域和錨蛋白重復結構域。

11.根據權利要求5所述的噬菌體載體，所述噬菌體載體還包含誘導型啟動子。

12.根據權利要求11所述的噬菌體載體，其中所述誘導型啟動子為lac啟動子或lac的突變體。

13.一種絲狀噬菌體顆粒，所述噬菌體顆粒包封有根據權利要求3所述的編碼與外源蛋白有效連接的分泌信號的多核苷酸，并且在所述噬菌體的表面上具有所述外源蛋白。

14.根據權利要求13所述的絲狀噬菌體顆粒，其中所述外源蛋白與絲狀噬菌體pVII或pIX蛋白的氨基末端融合，因此當所述蛋白質在絲狀噬菌體蛋白質的表面表達時，一個外源蛋白內的半胱氨酸殘基與同一絲狀噬菌體顆粒的表面上表達的第二外源蛋白上的半胱氨酸殘基氧化鍵合而形成功能性蛋白質結構。

15.根據權利要求14所述的絲狀噬菌體顆粒，其中所述功能性蛋白質結構包含抗體Fc區。

16.根據權利要求15所述的絲狀噬菌體顆粒，其中所述蛋白質結構的功能活性為FcRn結合。

17.一種細菌宿主細胞，所述宿主細胞包含根據權利要求13所述的絲狀噬菌體。

18.一種根據權利要求17所述的包含絲狀噬菌體載體的細菌宿主細胞的噬菌體文庫。

19.根據權利要求14所述的噬菌體文庫，其中所述每一種多核苷酸編碼具有氨基酸置換的形成Fc的序列。

20.根據權利要求15所述的噬菌體文庫，其中所述核酸鏈其中所述形成Fc的序列還包含配體結合結構域。

21.根據權利要求16所述的噬菌體文庫，其中所述配體結合結構域選自受體結合配體、受體胞外結構域、包含可變結構域和恒定結構域的抗體Fab結構域以及單鏈Fv構建體。

22.根據權利要求17所述的噬菌體文庫，其中所述Fab結構域包含在所述結合結構域內各特定殘基處相互不同的序列。