[發明專利]一種雞傳染性腦脊髓炎活疫苗中病毒含量測定方法

有效

• 申請號: 201410745901.3
• 申請日: 2014-12-07
• 公開（公告）號: CN104407136A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發明（設計）人: 張恒;王紅;范根成;杜元釗;郭莉莉;宮曉;申洪銀;陶曉珊;鄒桂榮
• 申請（專利權）人: 青島易邦生物工程有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明屬于家禽病毒檢測技術領域，具體涉及一種雞傳染性腦脊髓炎活疫苗中病毒含量測定方法。

背景技術

禽腦脊髓炎(Avian?Encephalomyelitis，AE)是由禽傳染性腦脊髓炎病毒(AEV)引起的以侵害雛禽中樞神經系統為主特征的傳染病，雞、火雞、野雞、鵪鶉均可感染本病，其臨床特征為病禽共濟失調，震顫和非化膿性腦脊髓炎。該病于1930年首次發現于美國羅德島，后傳至美國新英格蘭地區，故又稱為新英格蘭病；1932年又根據發病雛雞特征性頭頸震顫，稱為禽流行性震顫。1938年Van?Roekel將其定名為禽腦脊髓炎。

AEV屬于小RNA病毒科腸道病毒屬。報道的所有分離株和疫苗株血清學上與Van?Roekel株相同。AEV容易在易感雞胚上復制，并且雞胚適應毒株能引起各種癥狀，尤其是肢體畸形，可以當作病毒感染分析的基礎模型。在用禽類細胞培養繁殖該病毒方面已經做了很多嘗試，并且已經證實通過接種雞胚尿囊液繁殖增加了病毒的滴度，并且無細胞病變。

到目前為止，對于禽腦脊髓炎活疫苗中病毒含量測定還沒有一種穩定性、重復性好的定量方法，還不能進行病毒含量測定。過去禽腦脊髓炎病毒含量的檢測方法一直采用將病毒進行梯度稀釋接種12日齡SPF雞胚，通過觀察雞胚出現病變的數量來確定病毒含量。但是該方法周期長，雞胚的存活質量會影響結果的穩定性。因此，有必要提供一種操作更方便，檢測更精確的方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種新型的用于檢測禽腦脊髓炎活疫苗中病毒含量測定方法，可以更靈敏、更特異的檢測到禽腦脊髓炎活疫苗中的病毒，并且對活病毒進行定量。

本發明首先提供一種用于檢測禽傳染性腦脊髓炎病毒的熒光免疫檢測試劑盒，該試劑盒包含有如下的組分：

1)用于檢測禽腦脊髓炎病毒的雞單因子血清抗體(一抗，工作濃度為1：40倍稀釋)；

2)二抗：FITC標記的兔抗雞IgG(工作濃度1：200倍稀釋)；

3)陽性對照樣品：AEV?Van?Roekel株；

4)固定液：按丙酮與無水醇體積比3：2配置的固定液；

5)PBS洗液：磷酸鹽緩沖液，按Nacl?8.0g；Kcl?0.2g；Na2HPO4?3.58g；KH2PO40.24g定容至1L，調至PH7.2。

作為試劑盒主要成分的雞單因子血清抗體(一抗)，其制備方法如下：是將禽腦脊髓炎活疫苗弱毒株按每羽份病毒滴度≥10^4.0EID₅₀口服免疫3～4周齡的雛雞，免疫28天后用禽腦脊髓炎強毒株進行腦內接種攻毒，采集攻毒后21天的無禽腦脊髓炎癥狀的雛雞血清，制備出用于檢測禽腦脊髓炎病毒的雞單因子血清抗體，能夠與禽腦脊髓炎病毒發生特異性反應。

本發明提供的試劑盒用于檢測禽腦脊髓炎活疫苗中病毒含量，其一種具體操作如下：

將禽腦脊髓炎活疫進行連續10倍梯度稀釋，共稀釋5個梯度(10^-2～10^-6)，每個梯度接種4個孔(24孔細胞培養板)，每孔取100μl稀釋的疫苗液接種于長成70％～80％的單層CEN細胞，剩余4個培養孔作為陰性對照，連續培養72小時后，利用構建的檢測AEV的熒光免疫檢測試劑盒進行IFA，計算顯微鏡下視野中陽性細胞(出現特異性綠色熒光)的個數，此梯度視野中至少有5個陽性細胞，隨機選擇至少5個區域計數。按照疫苗病毒滴度(IFU/ml)＝(平均陽性細胞數/區域)×(稀釋比例)/(0.1ml)的公式計算疫苗中病毒含量。

所述的雞胚腦神經膠質細胞(CEN)制備方法：是將12日齡SPF雞胚的大腦組用PBS洗滌后，用0.25％的胰酶溶液消化15min，1000r/min離心5min，沉淀用M199培養液洗滌1次，然后用胰酶繼續處理5min，直到細胞完全消化開。然后用1000r/min離心10min收集細胞，并用M199生長液(10％胎牛血清，2％NaHCO₃，青霉素100U/ml和鏈霉素100μg/ml)重懸，然后進行培養并連續1～2次傳代則制備成功。