[發明專利]一種FRAX綜合癥相關基因FMR1檢測試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201410745451.8
• 申請日: 2014-12-09
• 公開（公告）號: CN104450911A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 趙書民;趙翊均;陳金中;周巍
• 申請（專利權）人: 上海五色石醫學研究有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;盛志范

1.?一種FRAX綜合癥相關基因FMR1突變的檢測試劑盒，其特征在于，包含有FRAX相關基因FMR1突變檢測探針組合物：包括第一對引物容器、第二引物容器、第三對引物容器和第四引物容器；所述第一引物容器內具有第一PCR引物對SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2的干燥粉末或溶液；所述第二引物容器內具有第二PCR引物對SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:3的干燥粉末或溶液；所述第三引物容器內具有第三PCR引物組SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:4和SEQ?ID?NO：6的干燥粉末或溶液，所述第四引物容器內具有第四組PCR引物SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:5和SEQ?ID?NO：6的干燥粉末或溶液。

2.?如權利要求1所述檢測試劑盒在FRAX綜合癥相關基因FMR1突變檢測中的應用，其特征在于具體步驟為；

（1）提取檢測對象的基因組DNA；

（2）采用平行對照方法，取等量基因組DNA建立HpalI酶切和對照體系，即兩管反應體系，HpalI酶可以切開非甲基化DNA；

（3）以經上述預處理的DNA為模板，分別建立4個PCR反應體系；把4個PCR體系擴增產物等量混合，然后進行毛細管電泳，收集數據后用GENEMAPPER軟件包分析；其中，藍色和黑色產物代表未處理DNA，反映FMR1對應區域長度或(CGG)n拷貝數；綠色和紅色產物代表甲基化可抵抗HpaII的DNA；通過比較藍色和綠色產物峰得出甲基化情況；對于綠色和紅色產物，因為一側引物處于(CGG)n區，在FMR1相應區域長度大于儀器設定量程時提供最小長度判斷。

3.?根據權利要求2所述的應用，其特征在于步驟（2）中所述采用平行對照方法，取等量基因組DNA建立HpaII酶切和對照體系即兩管反應體系，其中A管僅使用HpaII酶緩沖液對照，B管使用HpaII酶切；A管DNA可以被4個引物組擴增，B管非甲基化DNA對應位點被切開，不能被擴增，而甲基化DNA保持完整可以被引物擴增；具體為：A管加入DNA模板100?ng，Hpa1I（NEB）緩沖液?1μL，Hpa?II?0.2?μL，加水到10　μL，?37℃?2Hr；80℃，20?min；B管加入DNA模板100?ng，HpaII（NEB）緩沖液?1μL，加水到10μL，?37℃?2Hr；80℃，20?min。

4.?根據權利要求2所述的應用，其特征在于步驟（3）中所述分別建立4個PCR反應體系，具體為：

第1管反應體系：

A管處理模板??????????????????1?μL

KOD-FX酶??????????????????????1單位

2×?KOD-FX?緩沖液???????5?μL

2.5?mM?dNTPs?????????????????1?μL

第一對引物混合物??????????1?μL

加水到10?μL；

第2管反應體系：

B管處理模板???????????????????1?μL

KOD-FX酶??????????????????????1單位

2×?KOD-FX?緩沖液???????5?μL

2.5?mM?dNTPs?????????????????1?μL

第二對引物混合物??????????1?μL

加水到10?μL；

第3管反應體系：

A管處理模板??????????????????1?μL

KOD-FX酶??????????????????????1單位

2×?KOD-FX?緩沖液???????5?μL

2.5?mM?dNTPs?????????????????1?μL

第三組引物混合物??????????1?μL

加水到10?μL；

第4管反應體系：

B管處理模板???????????????????1?μL

KOD-FX酶??????????????????????1單位

2×?KOD-FX?緩沖液???????5?μL

2.5?mM?dNTPs?????????????????1?μL

第四組引物混合物??????????1?μL

加水到10?μL；

反應條件：KOD-FX，98℃?2分鐘；98℃?20秒、68℃?4分鐘共40個循環；68℃保溫60分鐘。