[發明專利]花生NBS-LRR基因及其在煙草抗青枯病中的應用

有效

• 申請號: 201410741491.5
• 申請日: 2014-12-09
• 公開（公告）號: CN104480117A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 莊偉建;張沖;陳華;鄧燁;蔡鐵城
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;C07K14/415;A01H5/00
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域????

本發明涉及一種花生青枯病抗性相關基因AhRRS5及其超表達載體的構建及在煙草抗青枯病基因工程中的應用，屬于植物基因工程技術領域。

背景技術????

植物在生長發育過程中會受到諸如細菌、病毒、真菌以及昆蟲等病原生物的侵擾，但是由于復雜而漫長的的生物進化過程中，植物已經形成了一套完整的，有效的防御病害侵染的機制。在植物和病原物互作過程中，一些病原物被植物的第一道防線阻止殺死，一些被植物的先天性免疫系統中的PTI抑制，但是還有一些病原物通過分泌毒性因子保持病原菌的毒力，這些毒性因子抑制PTI，引發植物感病，導致植物產生效應物引發的感病性（effector-triggered?susceptibility,?ETS），通常植物會產生一種由效應物引發的先天性免疫反應即ETI，?ETI通常是由R蛋白介導的，R基因編碼的產物能直接或間接識別病原菌的效應蛋白（無毒蛋白，avr-R），并侵染部位啟動快速的防御應答機制，通常會引起植物細胞的超敏反應（HR），激發下游一系列防衛反應。

由R基因介導的植物抗病性研究早已有報道，根據Flor的“基因對基因”假說，植物細胞中的R基因能夠專一性識別病原物中的無毒基因(avirulence?gene，avr），并激發植物的抗病反應，只有當攜帶R基因的植物與帶有avr基因的病原物發生作用時，植物才能表現抗病，缺少任何一方都會導致感病。這一遺傳假說對于解析植物宿主-病原物的互作關系提供了理論基礎。目前R蛋白和avr蛋白直接的作用的證據并不多，多數情況下抗病基因編碼的R蛋白是通過植物中稱之為“衛士蛋白”的其他蛋白協作與無毒Avr蛋白間接相互作用。最近，“誘餌模型”認為衛士蛋白被“誘餌蛋白”所取代，“誘餌蛋白”只是替代物而不是Avr作用的目標。大部分的R基因通常包括核苷酸結合位點（nucleotide?binding?site,?NBS）和亮氨酸富集重復(leucine-rich?repeat,?LRR)結構域，NBS結構域通常由不同的保守結構域組成如P-Loop，GLPL，Kinase-2?和Kinase-3a模塊，這些保守的模塊在植物的信號轉導中起重要作用，在病原菌侵染時這些模塊通常能夠通過激酶區的激活來誘導防御反應。LRR結構域通常由包含亮氨酸的24個氨基酸殘基，在植物與病原菌互作起著蛋白之間的互作以及植物與病原菌的識別作用。NBS-LRR類抗病基因根據N端的結構差異分為兩大亞類：TIR-NBS-LRR類抗病基因和CC/LZ-NBS-LRR類抗病基因。

目前已經在單雙子葉植物中克隆得到了70多個抗病基因，大量的R基因通過圖位克隆和轉座子標簽等方法已經在農作物上克隆和鑒定。由于大多數植物的抗青枯病基因并不是單個基因控制的，而是由數量遺傳性狀控制的，而這種數量性狀控制青枯病抗性的位點在很多植物上如番茄，茄子，煙草，苜蓿等被鑒定，由單基因控制的青枯病抗性目前只有擬南芥上兩個基因RRS1-R和ERECTA，擬南芥上通過圖位克隆獲得的一個抗青枯病基因RRS1-R是一類典型TIR-NB-LRR類抗病基因，而且在其C端具有一個可以激活下游防御基因表達的轉錄因子WRKY，青枯菌的PopP2是抗病基因RRS1-R對應的無毒基因，在其N端有一個便于向核內轉運的細胞核定位信號(nuclear?located?signal，NLS)；RRS1-R基因的N端的LRR結構域能夠識別并結合無毒蛋白PopP2，在PopP2核定位信號NLS使得RRS1-R蛋白導向細胞核內，在核內會通過WRKY轉錄因子結構域活化下游信號的傳導，進而引發下游防御相關基因的表達，從而產生對青枯菌的抗性。而ERECTA是擬南芥另外一個抗青枯病的基因是LRR-RLK類基因，并不是嚴格意義上的NBS-LRR類基因，但是ERECTA基因是通過胞外激酶區磷酸化調控下游基因對青枯病的防御反應。