[發(fā)明專利]基于基因沉默技術(shù)的煙粉虱防御素基因片段及其dsRNA

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410737862.2
• 申請(qǐng)日: 2014-12-07
• 公開（公告）號(hào): CN104480115A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳學(xué)新;王知知;時(shí)敏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C12N15/113;C12N15/63;C12N15/10;A23K1/16
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一基于基因沉默技術(shù)的煙粉虱防御素(defensin)基因片段及其dsRNA。

背景技術(shù)

煙粉虱Bemisia?tabaci(Gennadius)已成為一種世界性的入侵性災(zāi)害性昆蟲，在世界各地暴發(fā)成災(zāi)，造成慘重的損失。煙粉虱共危害對(duì)不同的植物表現(xiàn)出不同的危害癥狀，葉菜類如甘藍(lán)、花椰菜受害葉片萎縮、黃化、枯萎；根菜類如蘿卜受害表現(xiàn)為顏色白化、無味、重量減輕；果菜類如番茄受害，果實(shí)不均勻成熟。該蟲不僅大量取食植物汁液，導(dǎo)致植物枯萎，而且傳播多種植物病毒，是重要的病毒傳播媒介，常導(dǎo)致植物病毒病大流行，使作物嚴(yán)重減產(chǎn)或絕收。但是目前尚不清楚煙粉虱傳播病毒的分子機(jī)制，對(duì)煙粉虱的功能基因研究也相對(duì)較少。

RNAi(RNA?interference)是由雙鏈RNA引發(fā)的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制(post-transcriptional?gene?silencing,PTGS)。長(zhǎng)dsRNA被核酸酶降解成21～23bp大小的片段,與具有序列同源性的mRNA結(jié)合并使之降解,從而抑制基因的表達(dá)。目前已成功的在果蠅、線蟲、錐蟲、小鼠和哺乳動(dòng)物中進(jìn)行了RNAi研究,，其機(jī)制也逐漸被認(rèn)識(shí)。由于RNAi可以特異性地抑制基因的表達(dá),同時(shí)可將抑制表達(dá)時(shí)間控制在發(fā)育的特定階段,產(chǎn)生類似基因敲除的功能,可用來促進(jìn)新基因功能的研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，針對(duì)目前煙粉虱免疫反應(yīng)研究狀況及其不足，提供基于基因沉默技術(shù)的煙粉虱防御素(defensin)基因片段及其dsRNA。

為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是：

提供一種煙粉虱防御素defensin編碼基因片段，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了煙粉虱防御素defensin編碼基因片段的dsRNA，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有前述的編碼基因的載體。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了煙粉虱防御素defensin基因片段的dsRNA的合成方法，是以權(quán)利要求3所述載體為模版，以上游引物P1與含T7啟動(dòng)子的下游引物P4、含T7啟動(dòng)子的上游引物P3與下游引物P2分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到兩個(gè)具有T7啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物，以此逆轉(zhuǎn)錄得到的煙粉虱防御素defensin基因的dsRNA；

所述上游引物P1、下游引物P2、上游引物P3、下游引物P4的核苷酸序列分別為：SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了利用前述dsRNA喂食煙粉虱的方法，具體步驟如下：

(1)將玻璃管的一端封好，用吸蟲器吸取新羽化的煙粉虱加入玻璃管內(nèi)，置于冰盒上，用紗布將玻璃管另一端封好；

(2)將蟲子拍打至玻璃管封口端，將另一端的紗布取下，將已經(jīng)準(zhǔn)備好的封口膜，貼紙的一面朝上，蓋到玻璃管管口上，將管豎立放置；

(3)用移液槍吸取含dsRNA的飼料滴在膜的中央，用一個(gè)新的封口膜，貼紙的一面朝下，貼在玻璃管管口上，將飼料和dsRNA封在兩層封口膜之間，然后將加好飼料和dsRNA的玻璃管放回養(yǎng)蟲室的養(yǎng)蟲架上；

(4)利用煙粉虱的趨光習(xí)性僅在飼料端給予光照，使其趨食飼料，并按步驟(3)每24h換一次含dsRNA的飼料。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明采用改進(jìn)的人工飼喂法進(jìn)行RNAi干擾實(shí)驗(yàn)，相對(duì)于注射法，減少了蟲體的機(jī)械損傷，便于操作，且是真正意義上的自然取食，可以廣泛地推廣。

本發(fā)明合成的defensin基因dsRNA能有效沉默defensin基因，其雙鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能更好的防止RNA酶的降解,為建立利用RNA干擾技術(shù)研究煙粉虱基因功能奠定了基礎(chǔ)并為控制害蟲的新策略提供新的實(shí)驗(yàn)手段。

附圖說明

圖1：煙粉虱dsRNA飼喂裝置，圖中：加載飼料的膜1、煙粉虱2、玻璃管3。

圖2：dsRNA穩(wěn)定性檢測(cè)。M：DNA?marker；1-4：dsGFP分別在DEPC-處理人工飼料中放置0h,6h,12h,24h；5-8：dsGFP在無菌水中放置0h,6h,12h,24h。

圖3：dsRNA對(duì)煙粉虱defensin基因轉(zhuǎn)錄水平的抑制。“*”表示該系數(shù)在0.05顯著性水平上是可以接受的，也就是說，該系數(shù)的可靠度在95％以上；“**”表示該系數(shù)在0.01的顯著性水平上可以接受，即它的可靠度在99％以上