[發明專利]基于核酸內切酶特異性識別的細胞分選系統

有效

• 申請號: 201410735762.6
• 申請日: 2015-08-04
• 公開（公告）號: CN104498595A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發明（設計）人: 藍田;J·蓋茨;鄭敦武
• 申請（專利權）人: 賽業（蘇州）生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/34;G01N33/68;C12N5/0784;C12N5/0783
• 代理公司: 上海卓陽知識產權代理事務所(普通合伙) 31262
• 代理人: 馬偉

1.一種基于核酸內切酶特異性識別的細胞分選系統，其特征在于，所述的分選系統包含以下組分：第一單鏈核苷酸、第二單鏈核苷酸、抗體、細胞分選介質、限制性內切酶；所述的第一單鏈核苷酸和第二單鏈核苷酸互補，且互補區域含有所述限制性內切酶的識別位點；所述的第一單鏈核苷酸、第二單鏈核苷酸、抗體、細胞分選介質均被修飾，修飾后的第一單鏈核苷酸可與修飾后的抗體相連接，修飾后的第二單鏈核苷酸可與修飾后的細胞分選介質相連接。

2.根據權利要求1所述的分選系統，其特征在于，所述的第一單鏈核苷酸或第二單鏈核苷酸的長度為6bp-1kb。

3.根據權利要求1所述的分選系統，其特征在于，所述的細胞分選介質為磁珠、分離柱或聚陽離子納米顆粒。

4.根據權利要求3所述的分選系統，其特征在于，所述的第一單鏈核苷酸被巰基修飾，所述的第二單鏈核苷酸被生物素修飾，所述的抗體被順丁烯二酰亞胺修飾，所述的磁珠被鏈霉親和素修飾。

5.一種從細胞樣品中分選目的細胞的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟：

a)合成互補的單鏈核苷酸，制備“磁珠/單鏈核苷酸”和“抗體/單鏈核苷酸”復合物；

b)在細胞樣品中加入“抗體/單鏈核苷酸”復合物，形成“單鏈核苷酸/抗體/細胞”復合物；

c)將“磁珠/單鏈核苷酸”復合物加入到“單鏈核苷酸/抗體/細胞”復合物中，形成“磁珠/雙鏈核苷酸/抗體/細胞”復合物；

d)通過外加磁場的作用，磁性吸附目的細胞，去除非目的細胞；

e)針對不同的目的細胞，每次使用不同的限制性內切酶剪切含有特定識別序列的雙鏈核苷酸，逐次洗脫不同的目的細胞。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟b)中細胞樣品的體積、細胞樣品中目的細胞個數、目的細胞對應的抗體質量的比例為：1mL細胞樣品∶10⁶-10⁹個目的細胞∶5-100μg目的細胞對應的抗體；步驟c)中所述的“單鏈核苷酸/抗體/細胞”復合物與“磁珠/單鏈核苷酸”復合物的個數比為1:5-1:100。

7.一種分選DC細胞、NK細胞和CIK細胞的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含以下組分：巰基與生物素修飾的三對單鏈核苷酸，CD3、CD56和HLA-DR抗體，鏈霉親和素磁珠，限制性內切酶BamH?I、EcoR?I、Hind?III。

8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的三對單鏈核苷酸的序列分別如SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.6所示。

9.一種從細胞樣品中分選DC細胞、NK細胞和CIK細胞的方法，其特征在于，它包括以下步驟：

a)合成三對互補的單鏈核苷酸，制備三種“磁珠/單鏈核苷酸”和三種“抗體/單鏈核苷酸”復合物，所述的抗體分別為CD3、CD56和HLA-DR抗體，所述的三對單鏈核苷酸片段的序列分別如SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.6所示；

b)在細胞樣品中加入三種“抗體/單鏈核苷酸”復合物，形成“單鏈核苷酸/抗體/細胞”復合物；

c)將三種“磁珠/單鏈核苷酸”復合物加入到“單鏈核苷酸/抗體/細胞”復合物中，形成“磁珠/雙鏈核苷酸/抗體/細胞”復合物；

d)通過外加磁場的作用，分離獲得與磁珠結合的細胞；

e)針對不同的目的細胞，分別使用限制性內切酶BamH?I、EcoR?I、Hind?III逐次洗脫。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，步驟b)中細胞樣品的體積、細胞樣品中目的細胞個數、目的細胞對應的抗體質量的比例為：1mL細胞樣品∶10⁶-10⁹個目的細胞∶5-100μg目的細胞對應的抗體，步驟c)中所述的“單鏈核苷酸/抗體/細胞”復合物與“磁珠/單鏈核苷酸”復合物的個數比為1:5-1:100。