[發(fā)明專利]促進丹參毛狀根中迷迭香酸和丹酚酸B積累的誘導法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410735636.0
• 申請日: 2014-12-05
• 公開（公告）號: CN104472363A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發(fā)明（設計）人: 梁宗鎖;楊東風;黃志成;郭萬里;祁哲晨;張曉丹
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發(fā)明涉及一種促進丹參毛狀根中迷迭香酸和丹酚酸B積累的誘導法。

背景技術

丹參(Salvia?miltiorrhiza)為唇形科植物丹參的根及根莖，有活血祛瘀，清熱安神、養(yǎng)血益氣之功效。丹酚酸是丹參有效成分之一，主要包括迷迭香酸和丹酚酸B等。由于在治療心血管系統(tǒng)疾病中的突出表現(xiàn)和無毒負作用的特點，丹參的應用和研究也越來越廣泛。

目前現(xiàn)有的丹參毛狀根可采用6,7-V培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。一般稱取新鮮丹參毛狀根0.15～0.2g接種于50mL的6,7-V培養(yǎng)基中進黑暗培養(yǎng)。丹參毛狀根在生產(chǎn)丹參有效成分方面有著巨大潛力，但活性成分含量較低已成為制約丹參毛狀根應用的瓶頸。

含30g/L蔗糖的6,7-V培養(yǎng)基的配方如表1所示，pH值為5.8，121℃滅菌20min。

表1、6,7-V培養(yǎng)基的配方

5-氮雜胞苷(5-aza)為無色結晶體，溶于水和甲醇。它能迅速磷酸化并結合入RAN和DNA，通過破壞核酸順利翻譯為蛋白質，而抑制了蛋白質的合成。此外它通過抑制乳清酸核苷酸脫羧酶而影響嘧啶的合成。它是作用于S期的細胞周期特異性藥。其主要用于：1、組織培養(yǎng)用：誘變劑，抑制核糖核酸合成；2、抗腫瘤藥物、抗代謝劑：主要適應證是對常規(guī)治療無效的急性髓性白血病；亦用于乳腺癌、黑色素瘤、腸癌等。已有研究表明，利用5-氮雜胞苷處理白樺懸浮細胞，能夠有效提高白樺次生代謝產(chǎn)物總三萜和齊墩果酸的積累。

但是，目前現(xiàn)有技術沒有告知5-氮雜胞苷(5-aza)能夠用于促進丹參毛狀根中迷迭香酸和丹酚酸B的積累。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種促進丹參毛狀根中迷迭香酸和丹酚酸B積累的誘導法，本發(fā)明通過使用5-氮雜胞苷處理丹參毛狀根，從而促進丹參毛狀根中次生代謝產(chǎn)物迷迭香酸和丹酚酸B的積累。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種促進丹參毛狀根中迷迭香酸和丹酚酸B積累的誘導法，包括以下步驟：

1)、丹參毛狀根的初培養(yǎng)：

在每100mL的6,7-V培養(yǎng)基中接種0.3～0.4g丹參毛狀根，于100～150rpm、24～26℃的培養(yǎng)條件下黑暗培養(yǎng)17～19天；

2)、丹參毛狀根的繼續(xù)培養(yǎng)：

然后添加5-氮雜胞苷溶液，使6,7-V培養(yǎng)基中5-氮雜胞苷的終濃度為9～11μM；于100～150rpm、24～26℃的培養(yǎng)條件下黑暗培養(yǎng)(誘導培養(yǎng))5～7天；從而實現(xiàn)促進丹參毛狀根中迷迭香酸和丹酚酸B的積累。

作為本發(fā)明的促進丹參毛狀根中迷迭香酸和丹酚酸B積累的誘導法的改進：

5-氮雜胞苷溶液的配制方法為：

將0.1221g的5-氮雜胞苷溶于5ml無菌水中，用0.22μm無菌濾頭過濾除菌；得5-氮雜胞苷溶液(于4℃冰箱保存)。

作為本發(fā)明的促進丹參毛狀根中迷迭香酸和丹酚酸B積累的誘導法的進一步改進：

步驟2)中5-氮雜胞苷的終濃度為10μM。

作為本發(fā)明的促進丹參毛狀根中迷迭香酸和丹酚酸B積累的誘導法的改進：

所述步驟1)和步驟2)的培養(yǎng)條件均為：110rpm，25℃；

步驟1)的黑暗培養(yǎng)時間為18天，步驟2)的黑暗培養(yǎng)(誘導培養(yǎng))時間為6天。

備注說明：丹參毛狀根的初培養(yǎng)和繼續(xù)培養(yǎng)均在超凈臺中進行(此為常規(guī)技術)。

收集經(jīng)本發(fā)明方法誘導處理后的丹參毛狀根，用蒸餾水沖洗，再用干凈的紙吸干水份，最后在50～60℃烘箱中干燥至恒重后進行迷迭香酸和丹酚酸B的含量檢測(為常規(guī)技術)。例如可采取以下步驟：

干燥毛狀根研缽中磨碎，過0.45mm篩，精密稱取0.01g，加入1mL甲醇-水提取液(由甲醇：水＝7:3的體積比混合而得)，25℃，于40K?HZ超聲參數(shù)下超聲提取45min(每間隔10min震蕩)，提取液12000rpm離心10min，取上清液過0.45μm濾膜，備用。

含量測定采用Waters?2996二元高效液相色譜儀，色譜柱為Waters?SunFire?C18(4.6mm*250mm,5μm)。流速1mL?min-1，柱溫30℃，上樣體積20μL.檢測波長280nm，流動相乙腈和水，梯度洗脫，測定迷迭香酸和丹酚酸B含量。

備注說明：

丹參毛狀根采用發(fā)根農(nóng)桿菌(ATCC15834)侵染丹參試管無菌苗獲得，此為常規(guī)技術。