[發明專利]一種基于點擊化學的二價銅離子的檢測方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201410735488.2
• 申請日: 2014-12-05
• 公開（公告）號: CN105717290B
• 公開（公告）日: 2018-02-06
• 發明（設計）人: 曾令文;王斗;葛晨晨
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/532
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明涉及一種二價銅離子的檢測方法及試劑盒，特別涉及一種基于點擊化學的二價銅離子的檢測方法及試劑盒。

背景技術

環境中離子的濃度直接影響人們的健康，過高或過低都會影響人們的健康。在眾多的離子中，重金屬離子的危害性更大，因此有必要對其含量進行精確的測定。

傳統的用于檢測重金屬離子的方法主要有石墨烯原子吸收光譜法（graphite furnace atomic absorption spectrometry，AAS）和電感耦合等離子原子發射光譜法（inductive coupled plasma atomic emission spectroscopy，ICP-AES）。這兩種方法對于重金屬離子的檢測準確可靠，但使用的儀器價格昂貴，需要經驗豐富的技術人員來操作，因而限制了其在基層實驗室的廣泛應用。近年來，各種檢測重金屬離子的生物傳感器不斷出現，其檢測的原理都是依賴于重金屬離子能夠切割其DNA酶結合的底物鏈的特定位點，然后使用一系列的方法來檢測釋放的底物鏈，檢測方法包括：熒光法，比色法，動力學光散射法和膠體金試紙條法等。

近年來，基于Cu⁺的點擊化學由于其高效和特異性而得到了廣泛的應用，它指的是一個分子的疊氮基團和另一個分子的炔基基團在Cu⁺的催化下，通過環加成反應形成一個三唑五元環而被連接在一起。并且，疊氮基團和炔基基團的之間的反應不受溶液中其它基團的干擾，特異性好。Cu⁺可以通過抗壞血酸鈉還原Cu²⁺產生。基于Cu⁺的點擊化學已經用于可視化檢測Cu²⁺，其檢測的原理多是基于比色法，操作復雜，重復性差，并且，這些方法的靈敏度都有待進一步提高。我們發明的這種檢測方法操作簡便，檢測結果使用肉眼就能觀察到，因此被可廣泛地應用于基層實驗室中。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，提供一種簡化操作時間和步驟的、靈敏度高的銅離子檢測方法及試劑盒。

本發明首先提供一種基于點擊化學的二價銅離子的檢測方法及試劑盒，其特征在于，包括如下步驟：

制備反應液步驟：將修飾了疊氮基團的短單鏈核酸（Click Azide序列）、修飾了炔基基團的標記有生物素的短單鏈核酸（Click CHCH序列）、待檢測樣品和抗壞血酸鈉先后加入磷酸緩沖液中，混勻，20℃-25℃條件下反應1小時，使Click Azide的疊氮基團和Click CHCH的炔基基團在Cu⁺催化的作用下環加成反應連接起來，形成一條有生物素標記的長鏈序列；

制備膠體金步驟：在圓底燒瓶中加入100 ml 0.01%的HAuCl4溶液，磁力攪拌加熱至沸騰，并向上述溶液中加入4 ml 1%枸櫞酸鈉，溶液變為酒紅色后，繼續煮沸10分鐘，停止加熱繼續攪拌15分鐘，得到膠體金溶液，膠體金溶液4℃避光保存；

制備膠體金顆粒-鏈霉親和素（AuNP-SA）偶聯物步驟：向1 mL 的上述膠體金溶液中加入0.1 M K₂CO₃ （6 μL）混勻，5分鐘后加入10 μg的鏈霉親和素（SA），室溫振蕩30分鐘。加入100μL 10 %牛血清白蛋白后封閉30分鐘，4°C離心（12×10³rpm）10 分鐘，得到AuNP-SA偶聯物。棄上清，用100μL硼酸緩沖液（0.2M，pH 9.0）重懸AuNP-SA偶聯物；

檢測步驟：將上述反應液加入2微升AuNP-SA偶聯物，轉移到試紙條上，加入40微升的上樣緩沖液，進行檢測，檢測反應時間為5-10min。

相應的，本發明還提供了一種基于點擊化學檢測二價銅離子的試劑盒，其特征在于，具有粘性的底板；硝酸纖維素膜粘貼在所述底板的中部；所述硝酸纖維素膜上劃有跟Click Azide片段互補核酸和Click CHCH核酸分別作為檢測線和質控線；金標墊粘貼在所述硝酸纖維素膜的一側的底板上，所述金標墊與所述硝酸纖維素膜之間有2-3mm的重疊；吸水紙粘貼在所述硝酸纖維素膜的另一側的底板上，所述吸水紙與所述硝酸纖維素膜之間有2-3mm的重疊；樣品墊，粘貼在所述底板上，所述樣品墊與所述金標墊之間有2-3mm的重疊。