[發明專利]基于二溫式RT-PCR檢測H4亞型禽流感病毒的試劑盒

在審

• 申請號: 201410734872.0
• 申請日: 2014-12-05
• 公開（公告）號: CN104498624A
• 公開（公告）日: 2015-04-08
• 發明（設計）人: 謝芝勛;吳嬡瓊;謝志勤;鄧顯文;劉加波;謝麗基;羅思思;黃莉;黃嬌玲;曾婷婷
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發明屬于PCR檢測病毒技術領域，涉及一種基于二溫式RT-PCR檢測H4亞型禽流感病毒的試劑盒。

背景技術

禽流感(Avian?Influenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒屬的禽流感病毒(AIV)引起的一種禽類的感染和/或疾病綜合征，主要引起禽類的全身或呼吸系統疾病。AIV亞型眾多，根據表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin,HA)和神經氨酸酶(Neuraminidase,NA)的抗原性差異，已鑒別出16種HA亞型(H1-H16)和9種NA(N1-N9)亞型；根據AIV致病力的差異可分為高致病性禽流感病毒(Highly?Pathogenic?Avian?Influenza?Virus,HPAIV)和低致病性禽流感病毒(Lowly?Pathogenic?Avian?Influenza?Virus,LPAIV)。HPAIV引起家禽的AI以全身感染、高發病率和高死亡率為特征；LPAIV引起家禽AI的臨床癥狀表現溫和，死亡率不高，但影響家禽的生長發育和生產性能。

H4亞型AIV屬于LPAIV，能隱性感染各種家禽及野生鳥類，宿主范圍比較廣，包括雞、火雞、鴨、野鴨、野鳥、鴕鳥、鸚鵡等，還可以跨種傳播，感染哺乳動物。薛峰等報道，在江蘇鹽城國家級自然保護區對野鴨、丹頂鶴等野禽AIV檢測中，H4亞型AIV分離率最高(38.5％)。雖然絕大多數LPAIV致病力低，但LPAIV可能為感染人類的AIV提供基因，潛在危害性不容忽視。因此，應加強對H4亞型AIV的監測。目前，國內已建立的快速檢測方法多數都是針對其他亞型AIV，如H1、H3、H5、H6、H7、H9亞型，而針對H4亞型AIV的快速檢測方法的未見報道。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供敏感性好、特異性強和重復性好的基于二溫式RT-PCR檢測H4亞型禽流感病毒的試劑盒，以簡便快速地檢測H4亞型禽流感病毒。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：H4亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測引物對，包括引物1和2，它們分別具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的堿基序列。

引物1和引物2的摩爾比為1∶1。

上述H4亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測引物對在PCR擴增方面的應用，PCR擴增的退火溫度為58.0℃-68.0℃。

PCR擴增的退火溫度為65℃。

基于二溫式RT-PCR檢測H4亞型禽流感病毒的試劑盒，包括引物對、PCR擴增緩沖液和水；

引物對包括引物1和2，它們分別具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的堿基序列，其濃度均為25pmol/μL，在PCR反應體系中的終濃度分別為0.5pmol/μL；

PCR擴增緩沖液為2×Taq?PCR?Mix。

引物1和2在PCR反應體系中的終濃度分別為0.5μmol/L。

上述基于二溫式RT-PCR檢測H4亞型禽流感病毒的試劑盒在PCR擴增方面的應用，PCR擴增的退火溫度為58.0℃-68.0℃。

PCR擴增的退火溫度為65℃。

針對目前缺乏對H4亞型禽流感病毒進行快速檢測和診斷的有效可靠的技術，發明人研究設計了一對特異性引物，據此建立了H4亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測方法，并制備了相應的檢測試劑盒。實驗證明，應用本發明可檢測H4亞型禽流感病毒，具有操作快速簡便、敏感性高、特異性強和重復性好等優點，特異性試驗結果顯示該法可特異性擴增出H4亞型禽流感病毒，不擴增其他常見禽病病原體；敏感性試驗結果顯示該法對H4亞型禽流感病毒檢測下限為1.48pg/μL；對86份臨床樣品進行檢測，臨床樣品檢測結果與病毒分離結果一致。本發明用于H4亞型禽流感病毒導致的禽類感染早期診斷及有效防制，可以節約時間的成本。

附圖說明

圖1是二溫式RT-PCR退火溫度優化結果電泳圖，圖中：M、DL1000?DNA?Marker；1、58℃；2、59℃；3、60℃；4、61℃；5、62℃；6、63℃；7、64℃；8、65℃；9、66℃；10、67℃；11、68℃；12、陰性對照。

圖2是二溫式RT-PCR的特異性試驗結果電泳圖，圖中：M、DL1000?DNA?Marker；1～3為3株不同的H4亞型禽流感病毒；4～9分別為H1、H3、H5、H6、H7、H9亞型AIV；10、NDV；11、IBV；12、ILTV；13、MG；14、ARV；15、陰性對照。