[發(fā)明專利]針對NGAL表位的納米抗體及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410734730.4
• 申請日: 2014-12-04
• 公開（公告）號: CN104479015A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 萬亞坤;母亞雯
• 申請（專利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N15/13;G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 沈振濤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種針對NGAL表位的納米抗體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

NGAL蛋白質(zhì)是在包括腎小管在內(nèi)的一些組織器官的中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞中表達(dá)的小分子分泌性蛋白。是Lipocalin蛋白家族新成員之一，由一條含197個(gè)氨基酸殘基的肽鏈構(gòu)成，全長5869bp，其分子量小(25KDa)且不易降解，因此易于從血清或尿液中檢出。最近的研究表明，NGAL是診斷急性腎損傷最有效的生物學(xué)標(biāo)志之一。正常情況下，NGAL蛋白質(zhì)水平維持一個(gè)較低的水平；當(dāng)腎臟在受到毒性物質(zhì)侵害或發(fā)生缺血性損傷刺激時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞分泌NGAL水平在2小時(shí)內(nèi)迅速顯著升高，并釋放到尿液和血漿中，因此被作為早期敏感的腎損傷生物標(biāo)志物。另外NGAL基因在多種惡性腫瘤中如：乳腺癌、食管癌、肝癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移也密切相關(guān)，可能在惡性腫瘤的早期診斷等方面存在著潛在的應(yīng)用價(jià)值。研究表明，NGAL可能參與了多種生命活動的過程，包括胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、炎癥免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)代謝、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等。目前市場常見的NGAL檢測方法，有些是ELISA試劑盒，需要板式或管式固定包被抗原或抗體，但是有一定的局限性，對NGAL蛋白的檢測不夠靈敏，且由于單克隆抗體本身對反應(yīng)環(huán)境的要求較高，也限制了很多更優(yōu)化的化學(xué)檢測方法的實(shí)施。

納米抗體技術(shù)，是在傳統(tǒng)抗體制備的基礎(chǔ)上，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)融合納米粒子概念進(jìn)行的抗體工程革命，從而研發(fā)出的最新、最小的抗體分子。普通的抗體蛋白由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，而1993年，Hamers-Casterman等報(bào)道從駱駝血液中發(fā)現(xiàn)的新型抗體天然缺失輕鏈,只有兩條重鏈，即重鏈抗體(HCAbs)。重鏈抗體(heavy?chain?antibody，hcAb)又稱納米抗體(Nanobody)或單域抗體(single?domain?antibody，sdAb)，是一種新型的抗體形式，以其分子量小、穩(wěn)定性強(qiáng)、可溶性好、易表達(dá)、產(chǎn)量高、免疫原性低、耐高溫、耐酸鉀等多種優(yōu)勢聞名。它具有獨(dú)特的重鏈可變區(qū)(VHH)，一個(gè)鉸鏈區(qū)和兩個(gè)恒定區(qū)(CH2和CH3)，而納米抗體缺乏輕鏈。因此，納米抗體僅靠3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity-determining?region，CDR)就具備了特異的抗原結(jié)合能力和高親合力，而普通抗體則需要6個(gè)CDRs。這些“重鏈抗體”能像正常抗體一樣與抗原等靶標(biāo)緊緊結(jié)合，但不像單鏈抗體那樣相互黏連聚集成塊。其晶體結(jié)構(gòu)直徑215nm、長4nm，分子量只有普通抗體的1/10，化學(xué)性質(zhì)很靈活，穩(wěn)定性好，可溶性高，表達(dá)容易、容易獲得且容易偶聯(lián)其他分子，并具有獨(dú)特的識別構(gòu)造表位，可作為疾病診斷和腫瘤診斷的工具，有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種針對NGAL表位的納米抗體及其應(yīng)用。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供的一種針對中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil?gelatinase-associated?lipocalin?NGAL)的納米抗體VHH鏈，包括框架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)：

其中，所述框架區(qū)有4個(gè)，分別為FR1至FR4；其中，F(xiàn)R1的氨基酸序列選自SEQ?ID?NO.5至SEQ?ID?NO.8中的一種，F(xiàn)R2的氨基酸序列選自SEQ?ID?NO.9至SEQ?ID?NO.12中的一種；FR3的氨基酸序列選自SEQ?ID?NO.13至SEQ?ID?NO.16中的一種；FR4的氨基酸序列選自SEQ?ID?NO.17至SEQ?ID?NO.20中的一種；

其中，所述互補(bǔ)決定區(qū)有3個(gè)，分別為CDR1至CDR3；其中，CDR1的氨基酸序列選自SEQ?ID?NO.21至SEQ?ID?NO.24中的一種；CDR2的氨基酸序列選自SEQ?ID?NO.25至SEQ?ID?NO.28中的一種；CDR3的氨基酸序列選自SEQ?ID?NO.29至SEQ?ID?NO.32中的一種。

本發(fā)明還提供了一種針對NGAL的納米抗體，它包括權(quán)利要求1所述的納米抗體VHH鏈。