[發(fā)明專利]獲取無菌微囊藻純種的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410730999.5
• 申請日: 2015-08-04
• 公開（公告）號: CN104498397A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 施麗梅;黃亞新;孔繁翔;龔伊;盧亞萍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務(wù)所 32230
• 代理人: 徐蓓

技術(shù)領(lǐng)域

發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及微生物的分離純化過程，特別是涉及原核微囊藻培養(yǎng)中去除污染細(xì)菌的方法，有效解決了難以獲得微囊藻無菌培養(yǎng)液的現(xiàn)狀，為微囊藻的分子生物學(xué)、生理學(xué)等特性研究提供了材料。

背景技術(shù)

微囊藻是形成藍(lán)藻水華的優(yōu)勢藻種，其形成的水華具有發(fā)生廣泛，面積大，產(chǎn)生毒素的特點(diǎn)。水華微囊藻嚴(yán)重影響水體水質(zhì)，引起了越來越多科學(xué)家的關(guān)注。

微囊藻的胞外產(chǎn)物富含多糖、蛋白質(zhì)等有機(jī)物質(zhì)，因而是細(xì)菌聚集的熱點(diǎn)生態(tài)位。無論是在野外還是在室內(nèi)培養(yǎng)過程中，微囊藻都不可避免的帶有大量污染的細(xì)菌，為微囊藻的生理、分子生物學(xué)等研究帶來了阻礙。因而去除微囊藻培養(yǎng)中的細(xì)菌室研究深入微囊藻生物學(xué)特性的重要步驟。

目前去除微囊藻中細(xì)菌的方法有紫外照射、使用抗生素等方法。然而，微囊藻和細(xì)菌同屬于原核生物，這些方法的使用容易引起微囊藻細(xì)胞的損傷，甚至發(fā)生變異，而且殘留的細(xì)菌可能產(chǎn)生抗性，為后續(xù)微囊藻的研究產(chǎn)生了較大的影響。在分離培養(yǎng)無菌微囊藻的過程中，也有直接采用劃線方法進(jìn)行，但是由于微囊藻細(xì)胞的膠鞘中含有多糖類物質(zhì)，容易粘附細(xì)菌，需要經(jīng)過很多次的劃線才能挑選出無菌微囊藻，這種方法非常緩慢，而且工作量很大，也不能高效快速的得到無菌的微囊藻。

因此，需要更加安全有效的方法去除微藻中的細(xì)菌。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明公開了一種去除微囊藻培養(yǎng)中附著細(xì)菌或者污染細(xì)菌的方法。該方法根據(jù)藻與細(xì)菌所具有不同的細(xì)胞特性，通過流式細(xì)胞儀分選技術(shù)，可以快速有效的減少并去除微囊藻培養(yǎng)中的細(xì)菌，獲得無菌微囊藻，從而用于微囊藻分子、生理等特點(diǎn)的研究。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

微囊藻培養(yǎng)液中細(xì)菌去除的方法，其特征在于首先打散微囊藻與細(xì)菌之間的粘附，其次通過流式細(xì)胞儀分選技術(shù)，以及分部收集，可以獲得微囊藻的無菌培養(yǎng)。

本發(fā)明所述的方法，其特征在于，采用如下步驟進(jìn)行微囊藻的純化：

（1）調(diào)節(jié)微囊藻培養(yǎng)液濃度

（2）超聲處理培養(yǎng)液

（3）采用流式細(xì)胞儀對微囊藻進(jìn)行多次分選，初步獲得微囊藻的純培養(yǎng)。

（4）進(jìn)一步采用分部收集或者劃線法純化，從而獲得無菌微囊藻。

本發(fā)明所述的方法，，其特征在于，步驟（1）所述細(xì)胞濃度為10⁴-10⁵個/ml。

本發(fā)明所述的方法，，其特征在于，步驟（2）所述的超聲處理條件為:?超聲波頻率20-45?kHz,?功率為30W，工作3s-5s，共三次

本發(fā)明所述的方法，，其特征在于，步驟（3）在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行。

本發(fā)明所述的方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

①低功率超聲波打散：破壞微囊藻與污染細(xì)菌之間的粘附，采用低功率30?W的超聲波方法，達(dá)到不破壞藻細(xì)胞，但是將聚集的細(xì)胞分散開。工作3?s，間歇3s，打散，鏡檢。

②流式細(xì)胞儀的滅菌處理：首先用70%乙醇沖洗除去流式細(xì)胞儀管道中的細(xì)菌，然后采用PBS沖洗半小時，并作為分選鞘液。其次，開紫外照射工作臺，已達(dá)到無菌工作狀態(tài)。

③流式分選：通過側(cè)向散射光（SSC，依據(jù)BD公司2.49um的nile小球，圈定約3um的區(qū)域），并通過熒光3?通道（FL3,激發(fā)波長為488nm，功率為80mW,微囊藻自帶的葉綠素a紅色熒光信號），將待處理的微囊藻培養(yǎng)液以低速率200-300個細(xì)胞/秒進(jìn)樣。根據(jù)所圈定的范圍，收集微囊藻細(xì)胞，采用無菌BG11培養(yǎng)基進(jìn)行收集，作為初次分選微囊藻。

④將第一次分選液作為待分選的培養(yǎng)液，按照同樣的設(shè)置進(jìn)行，收集為二次分選液，以此類推，一般獲得三次分選培養(yǎng)液，可將絕大部分細(xì)菌去除。

⑤將第三次分選液通過分部收集或者在BG11固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，可以獲得無菌微囊藻。其中分部收集可立即獲得微量的無菌微囊藻；劃線培養(yǎng)一般需要一個月的時間能獲得微囊藻無菌藻落，然后再轉(zhuǎn)接無菌BG11液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。

本發(fā)明所帶來的有益效果為：

可以高效快速的得到無菌微囊藻，并且不會對藻細(xì)胞造成不可恢復(fù)的傷害。對于需要微量的無菌微囊藻進(jìn)行分子生物學(xué)的研究，使用本發(fā)明，只需要一天就能獲得。

附圖說明：

圖1?微囊藻培養(yǎng)中的顯微鏡檢照片；

圖2?經(jīng)過流式細(xì)胞儀初次分選后的微囊藻的顯微圖片；

圖3經(jīng)過流式細(xì)胞儀三次分選后的微囊藻的顯微圖片；

圖4?流式細(xì)胞儀分選門的設(shè)定。

具體實施方式