[發明專利]一種培育楊樹轉抗蟲基因的方法

在審

• 申請號: 201410730433.2
• 申請日: 2014-12-05
• 公開（公告）號: CN105713918A
• 公開（公告）日: 2016-06-29
• 發明（設計）人: 滿書岐
• 申請（專利權）人: 滿書岐
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;C12Q1/68
• 代理公司: 鞍山大千專利事務所 21110
• 代理人: 吳福山

1.一種培育楊樹轉抗蟲基因的方法，其特征在于：采用優良品種楊樹為試材，進行組培再生、農桿菌介導的抗蟲基因轉化及轉基因植株的抗蟲性試驗，建立高效的外植體再生體系、進行遺傳轉化條件試驗，確定葉片及莖段外植體對潮霉素抗性的臨界濃度、獲得轉基因再生植株，組培快繁了大量轉基因楊樹苗；

試驗選用的材料為：

（1）、菌種和質粒：含Bt基因的植物表達載pCUBVgb轉化的根癌農桿菌LBA4404；

（2）、植物材料：歐美楊107；

（3）、供試昆蟲：榆毒蛾幼蟲和天幕毛蟲幼蟲；

（4）、化學試劑：卡那霉素、羧芐青霉素、潮霉素、利福霉素；擴增引物、Taq酶；

（5）、培養基：農桿菌培養基、蔗糖、酵母提取物、瓊脂；葉片、生根培養基；

培育楊樹轉抗蟲基因的方法按下列步驟：

（1）、潮霉素臨界濃度的確定：

設計4個潮霉素的濃度梯度，在楊樹不定芽分化培養基中加入上述濃度的潮霉素，取生長健壯的無菌苗葉片及莖段置于培養基中，定期觀察分化情況確定葉片及莖段對潮霉素的抗性濃度；

（2）、菌種的活化

將含有植物植物表達載體的農桿菌菌液置于恒溫箱中，培養形成單菌落；挑取農桿菌單菌落，接種于液體培養基中用于轉化；

（3）、葉盤法轉化楊樹：

利用葉盤法對楊樹進行抗蟲基因轉化，取生長健壯的無菌苗葉片和莖段，投入到用MS液懸浮稀釋的菌液中，轉入選擇分化培養基中培養；

（4）、轉化植株：

經過農桿菌侵染的葉片及莖段外植體在芽選擇分化培養基上，有抗性芽產生，將抗性芽同外植體一起繼續進行選擇培養，轉移至生根培養基上誘導生根；

（5）、轉化植株的鑒定：

采用潮霉素抗性鑒定、轉基因植株的PCR檢測、植物總DNA的提取、總DNA的PCR擴增：以轉化植株中提取的植物總DNA為模板，用PCR儀檢測轉基因植物中外源基因的整合情況，以未經轉化的107楊DNA的PCR產物為陰性對照；

（6）、轉基因植株抗蟲活性測定、轉基因植株苗其生長與形態觀察，求平均值和標準差進行檢驗，觀察生長正常的一年生和兩年生苗木的干形、分角、葉片形態。