[發明專利]一種PAGE的高效銀染方法

在審

• 申請號: 201410727628.1
• 申請日: 2014-12-01
• 公開（公告）號: CN104458388A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 崔興雷;孟菲;蔡小彥;劉方;周忠麗;王星星;王春英;王玉紅;王坤波
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院棉花研究所
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N27/447
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司 11318
• 代理人: 高宇

技術領域

本發明屬于分子遺傳學領域，具體涉及一種適用于聚丙烯酰氨凝膠的高效銀染方法。

背景技術

聚丙烯酰氨凝膠電泳是目前常用的檢測DNA的方法，其分辨率好，能檢測出DNA片段間甚至1bp大小的差異，且通量高，可以在樣品量較少的情況下進行大批量的檢測。銀染法憑借其毒性輕、污染小等優點，是聚丙烯酰氨凝膠電泳中常用的一種染色方法。

該染色技術的首次應用是在蛋白的檢測上(Switzer?et?al.1979)，隨后該技術被廣泛的應用在核酸的檢測上(Guo?et?al.2008)。如今隨著數量性狀的遺傳定位、遺傳圖譜的構建、關聯分析等研究的快速發展，越來越多的核酸片段需要銀染法來染色檢測(Liang?et?al.2014)。然而傳統的銀染方法往往藥品配置復雜、過程繁瑣、所需時間較長。

本發明優化了各個處理液的配方，且在不影響檢測靈敏度的基礎上大幅縮短了銀染所需時間，提高了實驗效率。

發明內容

本發明的目的是提供一套適用于聚丙烯酰氨凝膠的高效銀染方法。

根據本發明的方法，通過配制固定液、滲透液和顯色液中主要藥品的不同濃度，對聚丙烯酰胺凝膠銀染方法中各個藥品的最適濃度進行了探討和改良。并經過大量的實驗，摸索出了在不影響染色質量的情況下三種處理液的較短處理時間，顯著提高了實驗效率。

根據本發明的適用于聚丙烯酰氨凝膠的銀染方法包括以下步驟：

1)聚丙烯酰氨凝膠電泳結束后，取下凝膠，浸泡在固定液中，處理2分鐘，所述固定液的配方為：10％體積比乙醇；1.0％體積比乙酸；

2)隨后取出凝膠，迅速放至水中，清洗20秒；把凝膠取出放入0.2wt％，AgNO₃滲透液中處理3分鐘，取出凝膠，迅速放至水中，清洗20秒；

3)把凝膠放進顯色液中，2分鐘即可顯色，所述顯色液配方為2wt％NaOH；20mL37v％HCOH/L；0.0175wt‰Na₂S₂O₃。

根據本發明的具體實施方式，所述方法包括以下步驟：

1)棉花基因組DNA的提取

把棉花種子浸泡于溫水中過夜，隨后沙培于光照培養箱內，培養一周左右至新鮮葉片展開，選取鮮嫩葉片0.5g在液氮中迅速碾磨至微白粉末，提取方法按照高含量酚的CTAB法，并稍作改進。提取的DNA濃度和質量分別用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計測定。把DNA原液稀釋至適宜濃度后放至‐20℃保存備用。

2)PCR擴增反應和聚丙烯酰氨凝膠電泳

PCR擴增程序為：95℃預變性2min；94℃變性40s，55℃退火45s(不同引物退火溫度有稍微區別)，72℃延伸1min，共30個循環；72℃延伸10min，4℃保存。

8％的聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測：采用BIO‐RAD公司的Power1000型電泳儀，PROTEAN?Ⅱ?Ⅺ?Cell電泳槽裝置。在擴增產物中加入0.5倍體積的上樣緩沖液，采用8％的聚丙烯酰胺凝膠檢測產物。

3)聚丙烯酰胺凝膠的銀染

聚丙烯酰氨凝膠電泳結束后，取下凝膠，浸泡在固定液(10％Ethanol；1.0％Acetic?acid)中，處理2分鐘，當固定液中含有乙醇時，條帶與凝膠的對比度有少量改善，條帶更加明顯(圖1)，乙酸含量的稍微改變對凝膠顯色結果影響微乎其微；隨后取出凝膠，迅速放至水中，清洗20秒；把凝膠取出放入滲透液(0.2％AgNO₃)中處理2分鐘，當銀離子濃度為0.2％時，滲透處理2-3min即可達到較好的效果，銀離子濃度減低時需適當加長滲透時間，當銀離子濃度達到0.3％或更高時，凝膠整體背景變深(圖2)；取出凝膠，迅速放至水中，清洗20秒；最后，把凝膠放進顯色液(2％NaOH；20mL?37％HCOH/L；0.0175‰Na₂S₂O₃)中，3分鐘即可顯色，顯色結果理想。當氫氧化鈉濃度小于1％時，凝膠底色開始明顯加重，條帶與底色的對比度降低，且隨著氫氧化鈉濃度的降低，這種現象越嚴重。較高的氫氧化鈉濃度對實驗結果的影響不是很大。甲醛(37％)的濃度過低時會導致條帶不明顯，處理時間加長，且會導致凝膠背景變暗紅，當濃度大于15mL?37％HCOH/L時，顯色效果理想，在120轉/分鐘的晃動下3min中即可得到很好的顯色結果(圖3)。所有處理過程都在120轉/分鐘的搖床上處理。處理中晃動頻率的降低會延緩實驗時間。