[發(fā)明專利]針對(duì)DD3基因的小干擾RNA及其表達(dá)載體構(gòu)建與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410719747.2
• 申請(qǐng)日: 2014-12-02
• 公開（公告）號(hào): CN104357451A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何金花
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/63;C12N15/867;A61K31/713;A61P35/00
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運(yùn)貞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及小干擾RNA技術(shù)，特別涉及一種針對(duì)DD3基因的小干擾RNA及其表達(dá)載體構(gòu)建與應(yīng)用。具體地說，涉及一種抗前列腺癌的小干擾RNADD3基因序列及重組慢病毒表達(dá)載體，提供了一種重組慢病毒表達(dá)載體介導(dǎo)的抗前列腺癌DD3小干擾RNA基因，具有靶向性抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及動(dòng)物瘤體的生長(zhǎng)，從而達(dá)到抑制前列腺癌的發(fā)展與轉(zhuǎn)移的作用。

背景技術(shù)

前列腺癌(carcinoma?of?prostate)已成為美國男性最常見的腫瘤。在美國男性腫瘤中的致死率中排第二位，僅次于肺癌。在歐盟排第三，次于肺癌和大腸癌。在我國，隨著社會(huì)人口的老齡化出現(xiàn)，前列腺癌的發(fā)病率也逐年增高。因此，對(duì)前列腺癌分子發(fā)病機(jī)制及前列腺癌診治新技術(shù)、新療法的研究尤為重要和迫切。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long?non-coding?RNA，LncRNA)，是指那些由DNA轉(zhuǎn)錄卻并不翻譯成蛋白的RNA，近來還有研究發(fā)現(xiàn)，在一些腫瘤組織中，LncRNA有著過表達(dá)或者低表達(dá)的現(xiàn)象。提示在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，它們可能發(fā)揮著重要的作用。細(xì)胞增殖、分化以及凋亡的異常導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，而LncRNA作為一個(gè)重要調(diào)控單位，參與調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，它們的異常表達(dá)有可能引起這些現(xiàn)象的發(fā)生。

DD3(differential?display?code?3)是一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA(>NR_015342.1)，又稱為前列腺癌基因3(prostate?cancer?gene?3，PCA3)，是近年來發(fā)現(xiàn)的前列腺癌高度特異性基因，是一個(gè)臨床潛力很高的前列腺癌標(biāo)志物。DD3基因僅在前列腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，具有較高的腫瘤特異性。DD3基因定位于9q21–22染色體上，含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。目前國外更多研究表明DD3基因的特異性區(qū)域位于外顯子4中。前列腺癌患者外周血中的DD3基因表達(dá)水平較正常對(duì)照組升高約34倍。前列腺腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生的分泌物、脫落的前列腺腺上皮細(xì)胞經(jīng)過導(dǎo)管排泄到尿道，前列腺癌細(xì)胞同樣可以排到尿道內(nèi)并且可以檢測(cè)出來，前列腺按摩后尿液標(biāo)本可以檢測(cè)到DD3的高表達(dá)。而尿液沉淀物能夠包含所有細(xì)胞和細(xì)胞碎片，更能準(zhǔn)確檢測(cè)DD3的表達(dá)。DD3可作為一種潛在的前列腺癌標(biāo)志物應(yīng)用到診斷中，甚至在不久的將來有可能會(huì)應(yīng)用到前列腺癌的治療中。

小干擾RNA(small?interference?RNA，siRNA)是生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象，它是指當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)內(nèi)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。由于siRNA能抑制特定基因的表達(dá)，應(yīng)用siRNA進(jìn)行基因治療有非常廣闊的臨床應(yīng)用前景。目前，各大生物技術(shù)公司都在積極開發(fā)這類藥物，并即將進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。原癌基因是細(xì)胞基因組中的正常組成成分，當(dāng)受到多種因素的作用使其發(fā)生變異時(shí)，激活成為癌基因，癌基因與細(xì)胞異常增殖及癌的發(fā)生有關(guān)?？梢詰?yīng)用siRNA技術(shù)來抑制癌基因的mRNA，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)，同時(shí)，還可通過siRNA技術(shù)促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期以及抑制血管生成等方面來治療癌癥。盡管RNAi技術(shù)作為腫瘤基因治療的新型工具仍然存在著許多急待解決的問題，如怎樣提高腫瘤細(xì)胞的靶向性等等。但隨著科學(xué)工作者對(duì)RNAi研究的不斷深入，siRNA技術(shù)將會(huì)成為一種非常有前景的腫瘤治療手段。

慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因治療效果，在美國已經(jīng)開展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

因此，如果能利用RNAi技術(shù)，涉及特異性針對(duì)DD3基因的siRNA，徹底研究清楚DD3和前列腺癌轉(zhuǎn)移的組織間的關(guān)系，將會(huì)為前列腺癌癌相關(guān)的癌癥的治療提供一種有益的途徑。因此，本發(fā)明的技術(shù)目的在于利用RNAi技術(shù)研究清楚DD3與前列腺癌的關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種針對(duì)DD3基因的siRNA。本發(fā)明通過大量篩選和實(shí)驗(yàn)工作得到針對(duì)DD3基因的siRNA。

本發(fā)明的另一目的在于提供所述的針對(duì)DD3基因的siRNA的編碼基因。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種載有針對(duì)DD3基因的siRNA重組表達(dá)載體。