[發明專利]一種膠孢炭疽菌的快速產孢方法

有效

• 申請號: 201410712920.6
• 申請日: 2014-12-02
• 公開（公告）號: CN104480060A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 林雄杰;范國成;王賢達;胡菡青;雷龑
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院果樹研究所
• 主分類號: C12N3/00
• 分類號: C12N3/00;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明屬于生命科學技術領域，具體涉及一種膠孢炭疽菌的快速產孢方法，適用于干燥保存、活化的等狀態下的膠孢炭疽菌的菌絲體的快速產孢，通常在24～48?h內即可迅速產孢，每平方厘米的孢子量可達7.8×10^7?~?6.5×10⁹個。

背景技術

膠孢炭疽菌寄主范圍十分廣泛，可侵染桃、油桃、蘋果、葡萄、芒果和梨等多種寄主引起炭疽病。膠孢炭疽菌菌株間從形態特征、致病性、分子遺傳水平、營養體親和群等方面都具有較大的變異，菌落可為灰白色至深灰色，氣生菌絲平坦，氈狀或者絮狀，分生孢子梗一般為無色，分生孢子為單胞，淡黃褐色，圓筒形或棍棒形，兩端鈍圓形，大小通常為12～26?μm×3.5～5?μm。關于膠孢炭疽菌孢子的研究極為普遍，它對炭疽菌的分類、致病性等的研究極為重要，而誘導產孢則成為研究中的一個關鍵環節，如何快速獲得大量孢子在很大程度上決定著研究的進展及成敗。

發明內容

本發明的目的是利用簡易可行的方法快速誘導膠孢炭疽菌菌絲體產孢，從而為加快后續的孢子、附著胞及致病性的相關研究奠定良好基礎，并為廣大科研工作節約了大量的寶貴時間。

為了實現以上目的，本發明的技術方案如下：

以PDA固體培養基培養的膠孢炭疽菌的菌絲體為產孢的基礎，通過刮菌絲、無菌水沖洗、干燥及光照培養措施誘導菌絲體在光照24～48?h條件下迅速萌發大量孢子。

具體包括以下步驟：

（1）將分離或已活化的膠孢炭疽菌重新轉接到PDA平板上，置于28℃恒溫培養箱中光照培養24～48?h；

（2）待菌落長至直徑為3～4.5cm時，在超凈工作臺中用無菌棉簽將中央的直徑為2~3.5cm氣生菌絲除去，并用無菌水將表面沖洗干凈，倒扣自然晾干；

（3）將晾干后的平板蓋上蓋子后平鋪于28?℃的恒溫培養箱中繼續光照培養24~48?h；

（4）光照24~48?h后即在平板表面看見橙紅色的分生孢子器，用無菌水將分生孢子器洗下并將其擠破，分生孢子則自動釋放到水中；定容至20?mL，取20?μL至血球計數板上觀察并計算單位面積的產孢量。

PDA固體培養基配方：馬鈴薯200g?，葡萄糖20?g，瓊脂20?g，定容至1?L。

一般光照24h后即可在平板表面看見少量橙紅色的分生孢子器，用無菌水將分生孢子器洗下并將其擠破，分生孢子則自動釋放到水中；光照48h后分生孢子器明顯增多，用適量無菌水將所有分生孢子器洗下后定容至20mL，取20μL至血球計數板上觀察并計算單位面積的產孢量。

所述的膠孢炭疽產孢量達7.8×10^7?~?6.5×10⁹個/cm²。

本發明的有益效果是：通過光照刺激使膠孢炭疽菌菌絲體在24～48h內即可快速產生大量分生孢大器和分生孢子，大大縮短了整個實驗周期，有效節約了人力物力及科研工作者的大量寶貴時間。

具體實施方式

實施例1

（1）將分離的膠孢炭疽菌重新轉接到PDA平板上，置于28?℃恒溫培養箱中光照培養24?h；

（2）待菌落長至直徑約為3?cm時，在超凈工作臺中用無菌棉簽將中央的直徑為2?cm氣生菌絲除去，并用無菌水將表面沖洗3次，倒扣自然晾干；

（3）將晾干后的平板蓋上蓋子后平鋪于28?℃的恒溫培養箱中繼續光照培養24?h左右；

（4）光照24?h后即在平板表面看見少量橙紅色的分生孢子器，用無菌水將分生孢子器洗下并將其搗破，分生孢子則自動釋放到水中，定容至20?mL，取20?μL至血球計數板上觀察并計算單位面積的產孢量。

所述的膠孢炭疽產孢量達7.8×10⁷個/cm²。

實施例2

（1）將已活化的膠孢炭疽菌重新轉接到PDA平板上，置于28?℃恒溫培養箱中光照培養48?h；

（2）待菌落長至直徑為4.5?cm時，在超凈工作臺中用無菌棉簽將中央的直徑為3.5?cm氣生菌絲除去，并用無菌水將表面沖洗干凈，倒扣自然晾干；

（3）將晾干后的平板蓋上蓋子后平鋪于28?℃的恒溫培養箱中繼續光照培養48?h；

（4）光照48?h后即在平板表面看見橙紅色的分生孢子器，用無菌水將分生孢子器洗下并將其搗破，分生孢子則自動釋放到水中，定容至20?mL，取20?μL至血球計數板上觀察并計算單位面積的產孢量。