[發明專利]一種細菌多糖修飾的重組融合蛋白的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201410709118.1
• 申請日: 2014-11-27
• 公開（公告）號: CN105695497B
• 公開（公告）日: 2019-09-24
• 發明（設計）人: 吳軍;潘超;孫鵬;王恒樑;劉波;彭哲慧;朱力;唱韶紅;鞏新;馮爾玲;王斌;曾明
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/70;C07K19/00;A61K39/104;A61K39/08;A61K39/106;A61K47/64;A61P31/04;C12R1/42;C12R1/19;C12R1/385;C12R1/01
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;陳曉慶

1.一種細菌多糖修飾的重組融合蛋白的制備方法，是將重組融合蛋白和腦膜炎奈瑟球菌O-寡糖轉移酶PglL在O-抗原連接酶基因缺陷的細菌中共表達，腦膜炎奈瑟球菌O-寡糖轉移酶PglL將細菌自身的多糖連接到所述重組融合蛋白上，得到所述細菌多糖修飾的重組融合蛋白；

所述重組融合蛋白含有N端信號肽、具有腦膜炎奈瑟球菌O-寡糖轉移酶PglL的糖基化位點的肽段和載體蛋白序列；

所述O-抗原連接酶基因缺陷的細菌為O-抗原連接酶基因缺陷的福氏志賀氏菌、O-抗原連接酶基因缺陷的甲型副傷寒沙門氏菌；

所述載體蛋白為細菌毒素蛋白的無毒突變體或細菌毒素蛋白的部分片段；

所述細菌毒素蛋白的無毒突變體為綠膿桿菌外毒素蛋白A無毒突變體；

所述細菌毒素蛋白的部分片段為霍亂毒素B亞單位或破傷風毒素C蛋白；

所述具有腦膜炎奈瑟球菌O-寡糖轉移酶PglL的糖基化位點的肽段為含有腦膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第55位至第66位的任意肽段。

2.一種細菌多糖修飾的重組融合蛋白的制備方法，是將重組融合蛋白、腦膜炎奈瑟球菌O-寡糖轉移酶PglL和外源多糖合成基因簇在O-抗原連接酶基因缺陷和O-抗原合成基因缺陷的細菌中共表達，腦膜炎奈瑟球菌O-寡糖轉移酶PglL將外源多糖連接到所述重組融合蛋白上，得到所述細菌多糖修飾的重組融合蛋白；

所述重組融合蛋白含有N端信號肽、具有腦膜炎奈瑟球菌O-寡糖轉移酶PglL的糖基化位點的肽段和載體蛋白序列；

所述O-抗原連接酶基因缺陷和O-抗原合成基因缺陷的細菌為O-抗原連接酶基因缺陷和O-抗原合成基因缺陷的大腸桿菌；

所述載體蛋白為細菌毒素蛋白的無毒突變體或細菌毒素蛋白的部分片段；

所述細菌毒素蛋白的無毒突變體為綠膿桿菌外毒素蛋白A無毒突變體；

所述細菌毒素蛋白的部分片段為霍亂毒素B亞單位或破傷風毒素C蛋白；

所述具有腦膜炎奈瑟球菌O-寡糖轉移酶PglL的糖基化位點的肽段為含有腦膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第55位至第66位的任意肽段。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述含有腦膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第55至第66位的任意肽段為如下任一所示的肽段：

（1）SEQ ID No.32中自N端起第128位至第156位氨基酸所示的肽段或其串聯重復序列；

（2）SEQ ID No.34中自N端起第128位至第154位氨基酸所示的肽段或其串聯重復序列；

（3）SEQ ID No.36中自N端起第128位至第152位氨基酸所示的肽段或其串聯重復序列；

（4）SEQ ID No.38中自N端起第128位至第150位氨基酸所示的肽段或其串聯重復序列；

（5）SEQ ID No.40中自N端起第128位至第149位氨基酸所示的肽段或其串聯重復序列；

（6）SEQ ID No.48中自N端起第22位至第40位氨基酸所示的肽段或其串聯重復序列；

（7）SEQ ID No.50中自N端起第22位至第36位氨基酸所示的肽段或其串聯重復序列；

（8）SEQ ID No.52中自N端起第22位至第33位氨基酸所示的肽段或其串聯重復序列。

4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述綠膿桿菌外毒素A無毒突變體的氨基酸序列如SEQ ID No.46中自N端起第20位至第631位所示；

所述霍亂毒素B亞單位的氨基酸序列如SEQ ID No.32中自N端起第20位至第122位所示；

所述破傷風毒素C蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.60中自N端起第20位至第455位所示。