[發明專利]金黃色葡萄球菌腸毒素檢測試劑盒及其制備和使用方法

在審

• 申請號: 201410707792.6
• 申請日: 2014-11-28
• 公開（公告）號: CN105652003A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 柳家鵬;王瑩
• 申請（專利權）人: 北京華安麥科生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種金黃色葡萄球菌腸毒素SEA、SEB檢測試劑盒及其制備和使用方法，屬于金黃色葡萄球菌腸毒素的免疫檢測領域。

背景技術

金黃色葡萄球菌是一種強致病的革蘭氏陽性菌，其耐藥性不斷增強，成為當今世界重要的食品、衛生安全問題之一。金黃色葡萄球菌腸毒素是金黃色葡萄球菌分泌的一類具有超抗原活性的細菌毒素，按血清學方法可分為七型。

金黃色葡萄球菌是醫院感染的常見菌。金黃色葡萄球菌腸毒素能引起中毒性休克癥狀，并在化膿性感染中起關鍵作用。此外，已發現金黃色葡萄球菌腸毒素與許多過敏和自身免疫疾病有關，并對機體產生長效的影響，如遺傳性過敏，多發性硬化，風濕性關節炎等。此外，金黃色葡萄球菌腸毒素作為一種細菌毒素，能引起毒性反應，導致各類中毒事件發生，是食物中毒最重要的細菌性毒素。金黃色葡萄球菌腸毒素對熱相當穩定，能抵抗蛋白酶消化，耐低pH，能通過胃腸道，引起嘔吐和腹瀉。人類對金黃色葡萄球菌腸毒素極為敏感，口服幾微克就可于2~4小時內出現中毒癥狀。在眾多的金黃色葡萄球菌腸毒素中，腸毒素A、B備受關注，金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒大部分由腸毒素A和腸毒素B導致。

為確保臨床病因的診斷和食品的衛生安全，對于腸毒素的檢測方法也在不斷發展，建立了各種檢測方法，具體包括：①免疫血清法：免疫血清法主要有瓊脂擴散法、固相放射免疫技術、酶聯免疫吸附試驗、免疫印跡技術、間接血凝抑制法和反向乳膠凝集試驗等。瓊脂擴散法敏感度較差，固相放射免疫技術所用儀器昂貴，而且存在放射性污染，也不易推廣。反相間接血凝抑制法靈敏度與放射免疫法相當，但受非特異性干擾易產生假陽性結果。反向乳膠凝集試驗出結果快，檢測腸毒素靈敏度也可以達到納克水平，但是存在的問題是葡萄球菌A蛋白的干擾，影響了結果的準確性。一般認為ELISA方法的靈敏度高于反相間接血凝抑制試驗，可達到納克級的水平。②聚合酶鏈反應：即PCR法，2000年，Mresh等應用單一反應PCR設計一種通用毒素基因引物和毒素特異性引物來擴增腸毒素基因，此法能快速對腸毒素基因進行檢測。PCR方法靈敏性高，特異性強，但需要專門的實驗技術人員和標準化實驗室，不適于大規模的流行病學調查及基層衛生單位應用。同時，但該方法需要對結果進行測序，才能最終確定腸毒素的血清型，時間周期長。③基因探針：同位素探針方法特異性高，敏感性強，重復性好，但因放射性問題難以推廣。而非放射性探針主要是生物素探針，在實際應用中存在信噪比差的缺點。④超抗原技術，此法的主要優點是可直接檢測SEA、SEB的生物學活性，但特異性不強，尚處于體外實驗研究階段。

酶聯免疫吸附測定法（ELISA）具有高效、靈敏、便于基層推廣等優點，而且可以直接采樣進行檢測，與HPLC、GC-MS檢測有較高的一致性，目前國內外尚無采用ELISA方法檢測金黃色葡萄球菌腸毒素SEA、SEB的報道。

發明內容

本發明克服了現有技術的不足，提供了一種金黃色葡萄球菌腸毒素SEA、SEB檢測試劑盒，并提供制備和使用方法。

為解決上述技術問題，本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明采用競爭酶聯免疫（ELISA）方法，在酶標板微孔條上預包被腸毒素SEA和SEB單克隆抗體，封閉后加入樣品，再加入酶標腸毒素抗體，清洗后，再加入底物顯色，樣本吸光度值與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中腸毒素A和B的含量。

高質量的抗體是此方法的關鍵試劑，其質量優劣直接影響檢測質量。

EL1SA檢測方法的建立：

1）包板：用包被緩沖液將金黃色葡萄球菌腸毒素SEA或SEB特異性單克隆抗體稀釋到0.1~1μl/ml，100μl/孔；

2）洗板：取出酶標板甩掉板內液體，用洗滌液（PBST）洗滌板孔，200~400μl/孔；

3）封閉：0.5%BSA的封閉液，100~200μl/孔，37℃放置2h。

4）反應時加入待測樣品，洗板后加入酶標抗體：每孔加入0.01mol/LPBS稀釋液緩沖液配制的標準品0.15~1.5ng/ml，50μl/孔，再加入1:5000~25000濃度的酶標抗體，30μl/孔，25℃放置15min~60min；

5）洗板：取出酶標板甩掉板內液體，用洗滌液（PBST）洗滌板孔，200~400μl/孔，洗1～5次，每次間隔20s，甩掉板內液體并拍干板孔；

6）底物：加入底物放置10~20min；