[發(fā)明專利]鴨甲肝病毒III型弱毒株及由其制備的活疫苗和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410707329.1
• 申請日: 2014-11-28
• 公開（公告）號: CN104498441A
• 公開（公告）日: 2015-04-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 藏玉婷;丁國杰;王彬;宋揚(yáng);孫德君;李來旭;李鑫;張春媛;于洪濤;孫凱;劉遠(yuǎn)倉;張祎;張鳳強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/08;A61K39/29;A61P31/14
• 代理公司: 北京康思博達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11426
• 代理人: 余光軍;李霞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及鴨甲肝病毒毒株，尤其涉及一株分離的鴨甲肝病毒III型強(qiáng)毒株以及由該強(qiáng)毒株連續(xù)傳代選育得到的鴨甲肝病毒III型弱化毒株，本發(fā)明還涉及該鴨甲肝病毒III型弱化毒株在制備預(yù)防鴨甲肝病毒III型活疫苗中的應(yīng)用，屬于鴨甲肝病毒毒株的分離及應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù)

鴨肝炎病毒(duck?hepatitis?virus,DHV)是鴨病毒性肝炎的致病病原。國際病毒分類系統(tǒng)于2010年4月修訂：鴨肝炎病毒命名為鴨甲肝病毒DHAV(DHAV)，屬小RNA病毒科，禽肝炎病毒屬。目前DHAV分為3個血清型，即：血清I型，血清II型和血清III型。其中血清I型為傳統(tǒng)鴨肝炎病毒，血清II型和血清III型為近幾年發(fā)現(xiàn)的新型病毒株，分別對應(yīng)臺灣新型和韓國新型。3個血清型之間無交叉反應(yīng)。

隨著DHAV?I型雞胚化弱毒疫苗、高免卵黃抗體的研制成功及臨床應(yīng)用，使本病在很大程度上得到很好的控制。但近幾年，在中國山東、河北、廣東等地免疫接種過DHAV?I型弱毒疫苗或注射過DHAV?I型高免卵黃抗體的鴨群中仍發(fā)生鴨肝炎，死亡率為20％-80％。經(jīng)病毒分離鑒定為血清III型，即韓國新型。

因此，目前亟需要研制一種能夠有效預(yù)防DHAV?III型的活疫苗。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一株鴨甲肝病毒(duck?hepatitis?A?virus,DHAV)III型強(qiáng)毒株；

本發(fā)明的目的之二是將所分離的鴨甲肝病毒(duck?hepatitis?A?virus,DHAV)III型強(qiáng)毒株通過傳代致弱篩選得到一株弱毒疫苗株；

本發(fā)明的目的之三是利用篩選的弱毒疫苗株制備得到有效預(yù)防鴨甲肝病毒(duck?hepatitis?A?virus,DHAV)III型的活疫苗。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明首先分離了一株鴨甲肝病毒(duck?hepatitis?A?virus,DHAV)III型毒株，命名為DHAV?III型JS株(DHAV-JS)。

本發(fā)明將分離的DHAV?III型毒株JS株提交專利認(rèn)可的機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏，其微生物保藏編號為：CGMCC?No.6852；分類命名是：鴨甲肝病毒；保藏時間是：2012年11月13日；保藏單位是：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所。

DHAV-JS株的PCR檢測結(jié)果顯示：在約714bp處出現(xiàn)了特異性的DNA條帶。DHAV-JS株VP1基因序列為SEQ?ID?NO.1所示。利用DNAMAN軟件，將JS株VP1基因序列與參考毒株的相應(yīng)序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：JS株與DHAV血清I型VP1的基因序列核苷酸同源性在62.0％～64.4％之間，JS株與DHAV血清II型VP1的基因序列核苷酸同源性在63.6％～63.8％之間。進(jìn)化樹分析表明，所分離到的JS株與SD02株(DHAV血清III型病毒)的親緣關(guān)系較近。

本發(fā)明將分離的DHAV-JS株經(jīng)過10日齡SPF鴨胚38℃培養(yǎng)5代，10日齡SPF鴨胚37℃培養(yǎng)12代，9日齡SPF雞胚37℃適應(yīng)培養(yǎng)13代，9日齡SPF雞胚37℃弱化27代，最終篩選獲得一株性能最優(yōu)良的DHAVIII型雞胚弱化毒株JS57株。

本發(fā)明將選育的DHAV?III型雞胚弱化毒株JS57株提交專利認(rèn)可的機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏，其微生物保藏編號為：CGMCC?No.9708；分類命名是：鴨甲肝病毒III型；保藏時間是：2014年09月28日；保藏單位是：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。

本發(fā)明所篩選的鴨甲肝病毒III型雞胚弱化毒株JS57株能夠應(yīng)用于制備預(yù)防由鴨甲肝病毒III型所導(dǎo)致的鴨病毒性肝炎的疫苗。

本發(fā)明公開了一種預(yù)防鴨病毒性肝炎的疫苗組合物，包括預(yù)防上有效量的鴨甲肝病毒III型雞胚弱化毒株JS57株和藥學(xué)上可接受的凍干保護(hù)劑。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種制備鴨甲肝病毒III型活疫苗的方法，包括以下步驟：

(1)培養(yǎng)DHAV?III型雞胚弱化毒株JS57株，得到病毒液；(2)在病毒液中加入凍干保護(hù)劑，研磨濾過；(3)加入抗生素，充分混合，定量分裝；(4)冷凍真空干燥，即得。

其中，步驟(1)將DHAV?III型雞胚弱化毒株JS57株接種9日齡SPF雞胚，挑選在孵育24～96小時之間死亡的胚胎，收集病毒液。