[發(fā)明專利]一種蘄蛇酶的生產(chǎn)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410706763.8
• 申請日: 2014-11-28
• 公開（公告）號: CN104357430A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發(fā)明（設計）人: 萬興平;蔣宗解;陳碧強;李玉潔;寧千年;余成恢
• 申請（專利權(quán)）人: 福建匯天生物藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64
• 代理公司: 福州市鼓樓區(qū)博深專利代理事務所(普通合伙) 35214
• 代理人: 林志崢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，特別涉及一種蘄蛇酶的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)

蘄蛇酶是從尖吻蝮蛇毒中分離純化的一種凝血酶樣酶，是絲氨酸型蛋白水解酶混合物。蘄蛇酶具有凝血酶樣酶活力，其分子量為24000～30000道爾頓，等電點為4.5～5.0。蘄蛇酶制劑‐‐蘄蛇酶注射液可用于治療急性腦梗塞及各種血栓性疾病，臨床上采用靜脈滴注給藥。

關(guān)于蘄蛇酶生產(chǎn)工藝已有文獻，中國專利申請公開號為CN1229136A的專利文件公開蘄蛇酶及其生產(chǎn)工藝，用已知的緩沖液溶解上葡聚糖凝膠G‐75柱，收集具有凝血酶樣酶活力的A、B峰，用DEAE‐葡聚糖凝膠A‐50柱層析，分別收集具有凝血酶樣酶活力的V、Ⅵ、Ⅶ峰。將收集到的具有凝血酶樣酶活力的V、Ⅵ、Ⅶ峰分別用CM‐葡聚糖凝膠C‐50柱層析，分別收集具有凝血酶樣酶活力的CM1、CM2、CM3峰。將收集到的有凝血酶樣酶活力的CM1、CM2、CM3峰分別用superdex75PG柱過濾，各得a，b兩峰，收集具有高凝血酶樣酶活力的b峰，混合為分子量24000～30000道爾頓及等電點4.5～5.0的蘄蛇酶。該生產(chǎn)工藝制備的蘄蛇酶的純度有待進一步提高，且生產(chǎn)工藝過程復雜、生產(chǎn)周期長，不易于產(chǎn)業(yè)化推廣。

現(xiàn)有技術(shù)中也存在采用初步經(jīng)凝膠過濾色譜層析，再經(jīng)離子交換色譜層析所得的目的組分，該組分用凝膠電泳檢測為一個蛋白組分，其實際是分子量和等電點相近的蛋白質(zhì)或多肽的混合物，需做進一步純化，即存在獲得的蘄蛇酶的純度不夠高的問題。此外，現(xiàn)有的蘄蛇酶生產(chǎn)工藝普遍存在生產(chǎn)工藝周期長的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種純度高、生產(chǎn)周期短的蘄蛇酶的生產(chǎn)方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種蘄蛇酶的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：

(1)在溫度為4～10℃條件下將蘄蛇毒凍干粉溶解于0.04～0.06mol/L、pH值為8～9的Tris‐HCl緩沖液中，靜置60min，0～10℃條件下離心獲得上清液，將上清液用0.01mol/L、pH值為8～9的Tris‐HCl緩沖液進行透析，獲得蘄蛇毒溶液；

(2)將所述蘄蛇毒溶液上DEAE‐Sepharose?Fast?Flow陰離子交換柱，進行洗脫分離，收集蛋白峰中具有凝血酶樣酶活力的蛋白峰，將收集的蛋白峰合并，然后用0.01mol/L、pH值為7～8的Tris‐HCl緩沖液進行透析。

(3)將步驟(2)獲得的溶液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，上SOURCE?30Q凝膠柱，進行層析，收集具有凝血酶樣酶活力的蛋白峰，將收集的蛋白峰溶液合并后上phenyl?sepharose?high?performance層析柱，進行層析，將層析后具有高凝血酶樣酶活力的蛋白峰，在真空度‐0.08MPa以下、5～10℃條件下進行濃縮，然后用0.01mol/L、pH值為7～8的Tris‐HCl緩沖液進行透析，將透析后得到的溶液在真空度‐0.08MPa以下，5～10℃條件下減壓濃縮，濃縮液經(jīng)0.22um微孔濾膜過濾；

(4)將步驟(3)獲得的溶液上Hiload?26/60Superdex75PG柱，收集具有凝血酶樣酶活力的第二個蛋白峰，即為蘄蛇酶溶液。

本發(fā)明的有益效果在于：

(1)制得的蘄蛇酶溶液為單一組分，純度在凝膠電泳上為單一條帶且經(jīng)高效液相檢測為一個單峰，純度大于98％；

(2)生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)工藝重現(xiàn)性好。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例的蘄蛇酶的生產(chǎn)方法的蘄蛇毒用DEAE‐Sepharose?Fast?Flow柱層析的色譜圖；

圖2為本發(fā)明實施例的蘄蛇酶的生產(chǎn)方法收集到的具有凝血酶樣酶活力的Ⅷ和Ⅸ蛋白峰用SOURCE?30Q柱層析的色譜圖；

圖3為本發(fā)明實施例的蘄蛇酶的生產(chǎn)方法收集到的具有凝血酶樣酶活力的S2峰和S3峰用phenyl?sepharose?high?performance柱層析的色譜圖；

圖4為本發(fā)明實施例的蘄蛇酶的生產(chǎn)方法收集到的具有凝血酶樣酶活力的P3峰用Hiload?26/60Superdex75PG柱層析的色譜圖；

圖5為本發(fā)明實施例的蘄蛇酶的生產(chǎn)方法的蘄蛇酶溶液(批號01)亞基分子量的薄層掃描圖；

圖6為本發(fā)明實施例的蘄蛇酶的生產(chǎn)方法的蘄蛇酶溶液(批號01)電泳法純度檢查的薄層掃描圖；