[發明專利]醛酮還原酶及其在合成(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸酯中的應用

有效

• 申請號: 201410706195.1
• 申請日: 2014-11-26
• 公開（公告）號: CN105624125B
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發明（設計）人: 羅煜;丁時澄;瞿旭東;李輝;王海濤
• 申請（專利權）人: 上海弈柯萊生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/63;C12N1/21;C12P13/02;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 于永進

本發明提供了一種新的醛酮還原酶突變體及利用重組醛酮還原酶突變體或其凍干粉進行不對稱還原的方法。在催化濃度高達1000g/L的底物時，產物的光學純度仍高達98％以上，且不需要額外添加昂貴的輔酶。相對于其它不對稱還原制備方法，使用本發明方法制備所得的產物濃度高，并且具有產物光學純度高、反應條件溫和、對環境友好、操作簡便、易于工業放大的優點，因此具有很好的工業應用前景。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種醛酮還原酶突變體，生產該醛酮還原酶突變體的基因工程菌的構建，及該醛酮還原酶突變體的生產方法及其在生物催化制備(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸酯中的應用。

背景技術

屬于酮還原酶(KRED)或羰基還原酶類的酶對于從相應的前體立體異構酮底物或相應的外消旋醛底物中合成旋光的醇有用。典型的，KRED將酮和醛底物轉化為相應的醇產物，但是也可催化逆反應，將醇底物氧化為相應的酮/醛產物。用如KRED的酶對酮和醛的還原以及醇的氧化需要輔因子，最常見的為還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，以及用于氧化反應的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)。NADH和NADPH作為電子供體，而NAD和NADP作為電子受體。經常觀察到酮還原酶和醇脫氫酶接受磷酸化的或非磷酸化的輔因子(以其氧化的或還原的狀態)。

KRED酶可在廣泛范圍內的細菌和酵母中發現(綜述參見：Kraus和Waldman，Enzymecatalysis in organic synthesis(有機合成中的酶催化)第1&2卷；VCH Weinheim 1995；Faber,K.,Biotransformations in organicchemistry(有機化學中的生物轉化)，第4版，Springs,Berlin HeidelbergNew York.2000；Hunnel和KuIa,1989,Eur.J.Biochem.184:1-13)。已經報道了一些KRED基因和酶序列，例如，木蘭假絲酵母、近平滑假絲酵母、赭色擲孢酵母。

4-乙酰氧基氮雜環丁酮(簡稱4AA)是一種重要的手性合成子，是合成碳青霉烯和青霉烯類新型廣譜抗生素的重要中間體，如用于合成亞胺培南、法羅培南、美羅培南等。

4AA的化學結構式如式I所示。4AA的分子骨架特征是一個四元內酰胺環， 共含有3個手性中心，存在8種立體異構體，如何高選擇性地建立手性中心，是合成4AA的關鍵所在。日本NOyori和Takasago公司采用以乙酰乙酸乙酯為起始原料的路線，各步的收率和立體選擇性都很好，總收率高達50％，是一條非常具有工業化前景的路線，該工藝路線如式1所示，其中R是含有1～6個碳原子的飽和低級烷基。在該路線中，乙酰乙酸乙酯首先與鹵化后N-羥甲基苯甲酰胺反應，生成2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸酯(式II)，然后利用手性催化劑(R)-BINAP-Ru經過羰基不對稱還原反應，生成(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸酯(式III)，再經過脫保護基、分子內成酰胺鍵、叔丁基二甲硅基保護、三氯化釕催化下的乙酰氧基化得到4AA。

在上述路線中，最關鍵的步驟是手性催化劑(R)-BINAP-Ru不對稱催化2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸酯(式II)生成(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸酯(式III)，但由于該過程需要使用到貴重金屬釕作為催化劑，并且需要在高溫高壓條件下進行，對反應器要求較高，因此造成該路線生產成本較高，限制了4AA大規模工業化生產。

近年來，利用生物催化進行不對稱反應的方法以其高度的化學、區域和立體選擇性，受到了越來越廣泛的關注。采用的生物催化劑既可以是提純的酶，也可以是微生物細胞。由于生物催化還原反應需要價格昂貴的輔酶參與，因此，通常采用具備輔酶再生系統的微生物全細胞作為催化劑。