[發(fā)明專利]與煙草株高發(fā)育性狀緊密連鎖分子標(biāo)記的獲得方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201410704784.6 | 申請(qǐng)日: | 2014-11-28 |
| 公開(公告)號(hào): | CN105624277B | 公開(公告)日: | 2021-05-18 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人: | 楊愛國(guó);程立銳;羅成剛;蔣彩虹;任民;張玉;馮全福 | 申請(qǐng)(專利權(quán))人: | 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所 |
| 主分類號(hào): | C12Q1/6895 | 分類號(hào): | C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11 |
| 代理公司: | 暫無(wú)信息 | 代理人: | 暫無(wú)信息 |
| 地址: | 266101 山東*** | 國(guó)省代碼: | 山東;37 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 煙草 發(fā)育 性狀 緊密 連鎖 分子 標(biāo)記 獲得 方法 | ||
1.一種與煙草株高發(fā)育性狀緊密連鎖分子標(biāo)記的獲得方法,其特征在于,建立一種獲得煙草株高發(fā)育性狀緊密連鎖分子標(biāo)記的新方法,包括以下步驟:
A)獲得煙草株高性狀的表型,在不同年份和不同地點(diǎn)在始花期調(diào)查株高性狀;
B)基于連鎖分析的煙草主效QTL定位,其中包括:
1)采用CTAB方法提取親本和群體基因組DNA,
2)根據(jù)表型鑒定結(jié)果,從雜交二代群體中各選取極端高和極端低的10個(gè)單株個(gè)體,等量混合DNA,構(gòu)建兩個(gè)極端池,進(jìn)而在雙親及兩個(gè)極端池間篩選與目標(biāo)性狀連鎖的SSR分子標(biāo)記,鑒定出的標(biāo)記進(jìn)步在整個(gè)雜交二代群體中分析基因型,
3)主效QTL定位分析,利用雜交二代群體SSR基因型,結(jié)合雜交二代和雜交三代兩年表型數(shù)據(jù),進(jìn)行QTL定位,利用的分析軟件為lcimapping3.2,LOD閾值設(shè)為2.5,當(dāng)某一位點(diǎn)的LOD值大于2.5時(shí)即認(rèn)為該處存在一個(gè)顯著QTL位點(diǎn),采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為完備區(qū)間作圖法,并估算相關(guān)遺傳參數(shù),相關(guān)遺傳參數(shù)包括QTL位置、加性效應(yīng)、對(duì)表型變異的加性貢獻(xiàn)率和顯性貢獻(xiàn)率;
C)基于關(guān)聯(lián)分析的煙草株高QTL定位,根據(jù)連鎖分析定位結(jié)果,在所在區(qū)間加密SSR標(biāo)記,利用加密的SSR標(biāo)記分析自然群體,結(jié)合連續(xù)兩年不同地點(diǎn)的表型數(shù)據(jù),進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析作圖,對(duì)相關(guān)QTL位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析驗(yàn)證,同時(shí)進(jìn)一步縮小QTL所在標(biāo)記區(qū)間位置,發(fā)掘影響煙草株高性狀的主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記;
發(fā)掘的煙草株高發(fā)育性狀QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記為PT55174,該標(biāo)記的前引物序列為TGCTTCCTGCTTCATACGTG,后引物序列為GGCTTGACTTCCATTTAATTTCC;
所述與煙草株高發(fā)育性狀緊密連鎖分子標(biāo)記的獲得方法具體包括:
(一)基于連鎖分析的煙草株高性狀主效QTL發(fā)掘
1)供試材料
以引進(jìn)優(yōu)質(zhì)烤煙品種NC82為母本,病毒病抗性品種抗88為父本構(gòu)建雜交一代、雜交二代和雜交三代人工群體為實(shí)驗(yàn)材料,兩個(gè)品種之間在株高發(fā)育上存在明顯差異,品種NC82在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期和生殖生長(zhǎng)期株高正常伸長(zhǎng),但是抗88在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期節(jié)距不伸長(zhǎng),呈″蓮花″狀,在生殖生長(zhǎng)期恢復(fù)正常;群體構(gòu)建過(guò)程如下:將NC82與抗88配置雜交種雜交一代,雜交一代自交獲得雜交二代,分別收獲雜交二代單株,構(gòu)建雜交三代株系;
2)田間表型鑒定與分析
第一年,以NC82為母本,抗88為父本配置雜交組合,收獲雜交一代種子,同期種植雜交一代,進(jìn)而收獲雜交二代種子;第二年,在大田條件下種植親本、雜交一代和雜交二代群體;親本和每分種植2行,每行25株,3次重復(fù),株距0.5米,行距1.2米;雜交二代群體大小為193個(gè)單株,按每行25株,株距和行距同親本,在始花期調(diào)查親本、雜交一代及雜交二代單株株高表型;第三年,種植親本、雜交一代及雜交三代群體,雜交三代群體大小143個(gè)株系,每個(gè)株系種2行,每行10株,2個(gè)重復(fù),調(diào)查每個(gè)雜交三代株系所有單株株高表型,以株系平均值代表該株系表型值;
3)DNA提取、PCR擴(kuò)增及凝膠電泳
從雜交二代群體中各選取極端高和極端低的10個(gè)單株個(gè)體,等量混合DNA,構(gòu)建兩個(gè)極端池,選取SSR標(biāo)記,合成引物;以雙親、雜交一代和兩個(gè)極端池基因組DNA為模板,進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)?PCR)反應(yīng),篩選獲得多態(tài)性標(biāo)記,進(jìn)而獲得分離群體的基因型,PCR反應(yīng)的產(chǎn)物通過(guò)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離,genefinder染色后,在凝膠成像系統(tǒng)下成像;
SSR-PCR合成體系為:1×的PCR緩沖液,1.5mmol/L Mg2+,150μmol/L dNTPs,150pmol/L引物,1.0 UTaq酶,40ng DNA,加ddH2O補(bǔ)足20μl;PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min;94℃變性30 sec,55℃退火30 sec,72℃延伸30 sec,運(yùn)行35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5min;
PCR產(chǎn)物電泳及染色:20μl的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1μl 6×上樣緩沖液,94℃變性5min,取出后置于冰水中迅速冷卻;用8%變性聚丙烯酰胺膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離;電泳時(shí),首先在恒功率60W條件下,預(yù)電泳20分鐘,然后恒定功率條件下對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離;電泳產(chǎn)物用genefinder染色;
4)煙草株高發(fā)育性狀主效QTL定位
根據(jù)雜交二代單株個(gè)體擴(kuò)增條帶所表示的基因型,將其對(duì)應(yīng)的株高調(diào)查結(jié)果作為表型值,對(duì)應(yīng)的株高調(diào)查結(jié)果包括雜交二代單株表型和相對(duì)應(yīng)的雜交三代株系株高平均值,進(jìn)而利用完備區(qū)間作圖軟件Icimapping3.2進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,LOD的閾值設(shè)為2.5,其中,permutationtimes設(shè)為1000次;
在不同群體不同環(huán)境條件下一個(gè)影響煙草株高發(fā)育性狀的主效QTL,命名為qPh-12,位于煙草12號(hào)連鎖群區(qū)間PT53703-PT60823之間,在雜交二代群體中可以解釋12.9%的表型遺傳變異,在雜交三代群體中解釋13.8%的表型遺傳變異;
(二)基于關(guān)聯(lián)分析的煙草株高發(fā)育性狀主效QTL驗(yàn)證和緊密連鎖分子標(biāo)記發(fā)掘:
1)供試材料及田間表型鑒定
用作關(guān)聯(lián)分析的自然群體由96份種質(zhì)資源組成,包括86份烤煙類型種質(zhì)、2份白肋煙類型種質(zhì)、1份雪茄煙類型種質(zhì)和7份曬晾煙類型種質(zhì)作為關(guān)聯(lián)分析的自然群體;每個(gè)品種種質(zhì)2行,每行25株,3次重復(fù),株距0.5米,行距1.2米,每份材料選擇10株有代表性的植株在始花期調(diào)查株高性狀;利用SAS8.0軟件進(jìn)行表型性狀基本統(tǒng)計(jì)量的分析;
2)DNA提取、PCR擴(kuò)增及凝膠電泳;
3)基于關(guān)聯(lián)分析的煙草株高發(fā)育性狀主效QTL定位及緊密連鎖分子標(biāo)記發(fā)掘:
首先利用均與分布在煙草24條連鎖群上的SSR標(biāo)記對(duì)96份自然群體進(jìn)行基因型分析,然后利用structure2.2對(duì)自然群體進(jìn)行群體結(jié)果分析,表明96份材料可分成兩個(gè)次級(jí)群體;相應(yīng)的Q矩陣作為協(xié)變量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析;然后在主效QTL位點(diǎn)qPh-12所在12號(hào)連鎖群上加密標(biāo)記,共利用46個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,所述46個(gè)SSR標(biāo)記信息如下:
;
采用定位軟件Tassel4.0一般線性模型開展標(biāo)記與性狀的關(guān)聯(lián)分析,GLM分析中以Q矩陣作為協(xié)變量進(jìn)行回歸分析;表明,在兩種不同環(huán)境條件下,總共有3個(gè)標(biāo)記與株高性狀顯著關(guān)聯(lián),其中標(biāo)記PT55174在兩種環(huán)境下都表現(xiàn)為與煙草主效性狀顯著關(guān)聯(lián)。
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