[發(fā)明專利]與煙草株高發(fā)育性狀緊密連鎖分子標(biāo)記的獲得方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410704784.6
• 申請(qǐng)日: 2014-11-28
• 公開（公告）號(hào): CN105624277B
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊愛國(guó);程立銳;羅成剛;蔣彩虹;任民;張玉;馮全福
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
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1.一種與煙草株高發(fā)育性狀緊密連鎖分子標(biāo)記的獲得方法，其特征在于，建立一種獲得煙草株高發(fā)育性狀緊密連鎖分子標(biāo)記的新方法，包括以下步驟：

A)獲得煙草株高性狀的表型，在不同年份和不同地點(diǎn)在始花期調(diào)查株高性狀；

B)基于連鎖分析的煙草主效QTL定位，其中包括：

1)采用CTAB方法提取親本和群體基因組DNA，

2)根據(jù)表型鑒定結(jié)果，從雜交二代群體中各選取極端高和極端低的10個(gè)單株個(gè)體，等量混合DNA，構(gòu)建兩個(gè)極端池，進(jìn)而在雙親及兩個(gè)極端池間篩選與目標(biāo)性狀連鎖的SSR分子標(biāo)記，鑒定出的標(biāo)記進(jìn)步在整個(gè)雜交二代群體中分析基因型，

3)主效QTL定位分析，利用雜交二代群體SSR基因型，結(jié)合雜交二代和雜交三代兩年表型數(shù)據(jù)，進(jìn)行QTL定位，利用的分析軟件為lcimapping3.2，LOD閾值設(shè)為2.5，當(dāng)某一位點(diǎn)的LOD值大于2.5時(shí)即認(rèn)為該處存在一個(gè)顯著QTL位點(diǎn)，采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為完備區(qū)間作圖法，并估算相關(guān)遺傳參數(shù)，相關(guān)遺傳參數(shù)包括QTL位置、加性效應(yīng)、對(duì)表型變異的加性貢獻(xiàn)率和顯性貢獻(xiàn)率；

C)基于關(guān)聯(lián)分析的煙草株高QTL定位，根據(jù)連鎖分析定位結(jié)果，在所在區(qū)間加密SSR標(biāo)記，利用加密的SSR標(biāo)記分析自然群體，結(jié)合連續(xù)兩年不同地點(diǎn)的表型數(shù)據(jù)，進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析作圖，對(duì)相關(guān)QTL位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析驗(yàn)證，同時(shí)進(jìn)一步縮小QTL所在標(biāo)記區(qū)間位置，發(fā)掘影響煙草株高性狀的主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記；

發(fā)掘的煙草株高發(fā)育性狀QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記為PT55174，該標(biāo)記的前引物序列為TGCTTCCTGCTTCATACGTG，后引物序列為GGCTTGACTTCCATTTAATTTCC；

所述與煙草株高發(fā)育性狀緊密連鎖分子標(biāo)記的獲得方法具體包括：

(一)基于連鎖分析的煙草株高性狀主效QTL發(fā)掘

1)供試材料

以引進(jìn)優(yōu)質(zhì)烤煙品種NC82為母本，病毒病抗性品種抗88為父本構(gòu)建雜交一代、雜交二代和雜交三代人工群體為實(shí)驗(yàn)材料，兩個(gè)品種之間在株高發(fā)育上存在明顯差異，品種NC82在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期和生殖生長(zhǎng)期株高正常伸長(zhǎng)，但是抗88在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期節(jié)距不伸長(zhǎng)，呈″蓮花″狀，在生殖生長(zhǎng)期恢復(fù)正常；群體構(gòu)建過(guò)程如下：將NC82與抗88配置雜交種雜交一代，雜交一代自交獲得雜交二代，分別收獲雜交二代單株，構(gòu)建雜交三代株系；

2)田間表型鑒定與分析

第一年，以NC82為母本，抗88為父本配置雜交組合，收獲雜交一代種子，同期種植雜交一代，進(jìn)而收獲雜交二代種子；第二年，在大田條件下種植親本、雜交一代和雜交二代群體；親本和每分種植2行，每行25株，3次重復(fù)，株距0.5米，行距1.2米；雜交二代群體大小為193個(gè)單株，按每行25株，株距和行距同親本，在始花期調(diào)查親本、雜交一代及雜交二代單株株高表型；第三年，種植親本、雜交一代及雜交三代群體，雜交三代群體大小143個(gè)株系，每個(gè)株系種2行，每行10株，2個(gè)重復(fù)，調(diào)查每個(gè)雜交三代株系所有單株株高表型，以株系平均值代表該株系表型值；

3)DNA提取、PCR擴(kuò)增及凝膠電泳

從雜交二代群體中各選取極端高和極端低的10個(gè)單株個(gè)體，等量混合DNA，構(gòu)建兩個(gè)極端池，選取SSR標(biāo)記，合成引物；以雙親、雜交一代和兩個(gè)極端池基因組DNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)?PCR)反應(yīng)，篩選獲得多態(tài)性標(biāo)記，進(jìn)而獲得分離群體的基因型，PCR反應(yīng)的產(chǎn)物通過(guò)8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，genefinder染色后，在凝膠成像系統(tǒng)下成像；

SSR-PCR合成體系為：1×的PCR緩沖液，1.5mmol/L Mg²⁺，150μmol/L dNTPs，150pmol/L引物，1.0 UTaq酶，40ng DNA，加ddH2O補(bǔ)足20μl；PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min；

PCR產(chǎn)物電泳及染色：20μl的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1μl 6×上樣緩沖液，94℃變性5min，取出后置于冰水中迅速冷卻；用8％變性聚丙烯酰胺膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離；電泳時(shí)，首先在恒功率60W條件下，預(yù)電泳20分鐘，然后恒定功率條件下對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離；電泳產(chǎn)物用genefinder染色；

4)煙草株高發(fā)育性狀主效QTL定位

根據(jù)雜交二代單株個(gè)體擴(kuò)增條帶所表示的基因型，將其對(duì)應(yīng)的株高調(diào)查結(jié)果作為表型值，對(duì)應(yīng)的株高調(diào)查結(jié)果包括雜交二代單株表型和相對(duì)應(yīng)的雜交三代株系株高平均值，進(jìn)而利用完備區(qū)間作圖軟件Icimapping3.2進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，LOD的閾值設(shè)為2.5，其中，permutationtimes設(shè)為1000次；

在不同群體不同環(huán)境條件下一個(gè)影響煙草株高發(fā)育性狀的主效QTL，命名為qPh-12，位于煙草12號(hào)連鎖群區(qū)間PT53703-PT60823之間，在雜交二代群體中可以解釋12.9％的表型遺傳變異，在雜交三代群體中解釋13.8％的表型遺傳變異；

(二)基于關(guān)聯(lián)分析的煙草株高發(fā)育性狀主效QTL驗(yàn)證和緊密連鎖分子標(biāo)記發(fā)掘：

1)供試材料及田間表型鑒定

用作關(guān)聯(lián)分析的自然群體由96份種質(zhì)資源組成，包括86份烤煙類型種質(zhì)、2份白肋煙類型種質(zhì)、1份雪茄煙類型種質(zhì)和7份曬晾煙類型種質(zhì)作為關(guān)聯(lián)分析的自然群體；每個(gè)品種種質(zhì)2行，每行25株，3次重復(fù)，株距0.5米，行距1.2米，每份材料選擇10株有代表性的植株在始花期調(diào)查株高性狀；利用SAS8.0軟件進(jìn)行表型性狀基本統(tǒng)計(jì)量的分析；

2)DNA提取、PCR擴(kuò)增及凝膠電泳；

3)基于關(guān)聯(lián)分析的煙草株高發(fā)育性狀主效QTL定位及緊密連鎖分子標(biāo)記發(fā)掘：

首先利用均與分布在煙草24條連鎖群上的SSR標(biāo)記對(duì)96份自然群體進(jìn)行基因型分析，然后利用structure2.2對(duì)自然群體進(jìn)行群體結(jié)果分析，表明96份材料可分成兩個(gè)次級(jí)群體；相應(yīng)的Q矩陣作為協(xié)變量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析；然后在主效QTL位點(diǎn)qPh-12所在12號(hào)連鎖群上加密標(biāo)記，共利用46個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，所述46個(gè)SSR標(biāo)記信息如下：

；

采用定位軟件Tassel4.0一般線性模型開展標(biāo)記與性狀的關(guān)聯(lián)分析，GLM分析中以Q矩陣作為協(xié)變量進(jìn)行回歸分析；表明，在兩種不同環(huán)境條件下，總共有3個(gè)標(biāo)記與株高性狀顯著關(guān)聯(lián)，其中標(biāo)記PT55174在兩種環(huán)境下都表現(xiàn)為與煙草主效性狀顯著關(guān)聯(lián)。