[發明專利]與煙草株高發育性狀緊密連鎖分子標記的獲得方法

有效

• 申請號: 201410704784.6
• 申請日: 2014-11-28
• 公開（公告）號: CN105624277B
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 楊愛國;程立銳;羅成剛;蔣彩虹;任民;張玉;馮全福
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院煙草研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
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1.一種與煙草株高發育性狀緊密連鎖分子標記的獲得方法，其特征在于，建立一種獲得煙草株高發育性狀緊密連鎖分子標記的新方法，包括以下步驟：

A)獲得煙草株高性狀的表型，在不同年份和不同地點在始花期調查株高性狀；

B)基于連鎖分析的煙草主效QTL定位，其中包括：

1)采用CTAB方法提取親本和群體基因組DNA，

2)根據表型鑒定結果，從雜交二代群體中各選取極端高和極端低的10個單株個體，等量混合DNA，構建兩個極端池，進而在雙親及兩個極端池間篩選與目標性狀連鎖的SSR分子標記，鑒定出的標記進步在整個雜交二代群體中分析基因型，

3)主效QTL定位分析，利用雜交二代群體SSR基因型，結合雜交二代和雜交三代兩年表型數據，進行QTL定位，利用的分析軟件為lcimapping3.2，LOD閾值設為2.5，當某一位點的LOD值大于2.5時即認為該處存在一個顯著QTL位點，采用的統計學方法為完備區間作圖法，并估算相關遺傳參數，相關遺傳參數包括QTL位置、加性效應、對表型變異的加性貢獻率和顯性貢獻率；

C)基于關聯分析的煙草株高QTL定位，根據連鎖分析定位結果，在所在區間加密SSR標記，利用加密的SSR標記分析自然群體，結合連續兩年不同地點的表型數據，進行關聯分析作圖，對相關QTL位點進行關聯分析驗證，同時進一步縮小QTL所在標記區間位置，發掘影響煙草株高性狀的主效QTL緊密連鎖的分子標記；

發掘的煙草株高發育性狀QTL緊密連鎖的分子標記為PT55174，該標記的前引物序列為TGCTTCCTGCTTCATACGTG，后引物序列為GGCTTGACTTCCATTTAATTTCC；

所述與煙草株高發育性狀緊密連鎖分子標記的獲得方法具體包括：

(一)基于連鎖分析的煙草株高性狀主效QTL發掘

1)供試材料

以引進優質烤煙品種NC82為母本，病毒病抗性品種抗88為父本構建雜交一代、雜交二代和雜交三代人工群體為實驗材料，兩個品種之間在株高發育上存在明顯差異，品種NC82在營養生長期和生殖生長期株高正常伸長，但是抗88在營養生長期節距不伸長，呈″蓮花″狀，在生殖生長期恢復正常；群體構建過程如下：將NC82與抗88配置雜交種雜交一代，雜交一代自交獲得雜交二代，分別收獲雜交二代單株，構建雜交三代株系；

2)田間表型鑒定與分析

第一年，以NC82為母本，抗88為父本配置雜交組合，收獲雜交一代種子，同期種植雜交一代，進而收獲雜交二代種子；第二年，在大田條件下種植親本、雜交一代和雜交二代群體；親本和每分種植2行，每行25株，3次重復，株距0.5米，行距1.2米；雜交二代群體大小為193個單株，按每行25株，株距和行距同親本，在始花期調查親本、雜交一代及雜交二代單株株高表型；第三年，種植親本、雜交一代及雜交三代群體，雜交三代群體大小143個株系，每個株系種2行，每行10株，2個重復，調查每個雜交三代株系所有單株株高表型，以株系平均值代表該株系表型值；

3)DNA提取、PCR擴增及凝膠電泳

從雜交二代群體中各選取極端高和極端低的10個單株個體，等量混合DNA，構建兩個極端池，選取SSR標記，合成引物；以雙親、雜交一代和兩個極端池基因組DNA為模板，進行聚合酶鏈式(PCR)反應，篩選獲得多態性標記，進而獲得分離群體的基因型，PCR反應的產物通過8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，genefinder染色后，在凝膠成像系統下成像；

SSR-PCR合成體系為：1×的PCR緩沖液，1.5mmol/L Mg²⁺，150μmol/L dNTPs，150pmol/L引物，1.0 UTaq酶，40ng DNA，加ddH2O補足20μl；PCR反應程序為94℃預變性5min；94℃變性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，運行35個循環；最后72℃延伸5min；

PCR產物電泳及染色：20μl的擴增產物中加入1μl 6×上樣緩沖液，94℃變性5min，取出后置于冰水中迅速冷卻；用8％變性聚丙烯酰胺膠對擴增產物進行分離；電泳時，首先在恒功率60W條件下，預電泳20分鐘，然后恒定功率條件下對擴增產物進行分離；電泳產物用genefinder染色；

4)煙草株高發育性狀主效QTL定位

根據雜交二代單株個體擴增條帶所表示的基因型，將其對應的株高調查結果作為表型值，對應的株高調查結果包括雜交二代單株表型和相對應的雜交三代株系株高平均值，進而利用完備區間作圖軟件Icimapping3.2進行數據分析，LOD的閾值設為2.5，其中，permutationtimes設為1000次；

在不同群體不同環境條件下一個影響煙草株高發育性狀的主效QTL，命名為qPh-12，位于煙草12號連鎖群區間PT53703-PT60823之間，在雜交二代群體中可以解釋12.9％的表型遺傳變異，在雜交三代群體中解釋13.8％的表型遺傳變異；

(二)基于關聯分析的煙草株高發育性狀主效QTL驗證和緊密連鎖分子標記發掘：

1)供試材料及田間表型鑒定

用作關聯分析的自然群體由96份種質資源組成，包括86份烤煙類型種質、2份白肋煙類型種質、1份雪茄煙類型種質和7份曬晾煙類型種質作為關聯分析的自然群體；每個品種種質2行，每行25株，3次重復，株距0.5米，行距1.2米，每份材料選擇10株有代表性的植株在始花期調查株高性狀；利用SAS8.0軟件進行表型性狀基本統計量的分析；

2)DNA提取、PCR擴增及凝膠電泳；

3)基于關聯分析的煙草株高發育性狀主效QTL定位及緊密連鎖分子標記發掘：

首先利用均與分布在煙草24條連鎖群上的SSR標記對96份自然群體進行基因型分析，然后利用structure2.2對自然群體進行群體結果分析，表明96份材料可分成兩個次級群體；相應的Q矩陣作為協變量進行關聯分析；然后在主效QTL位點qPh-12所在12號連鎖群上加密標記，共利用46個SSR標記進行關聯分析，所述46個SSR標記信息如下：

；

采用定位軟件Tassel4.0一般線性模型開展標記與性狀的關聯分析，GLM分析中以Q矩陣作為協變量進行回歸分析；表明，在兩種不同環境條件下，總共有3個標記與株高性狀顯著關聯，其中標記PT55174在兩種環境下都表現為與煙草主效性狀顯著關聯。